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Silices sphériques et silices irrégulières : quelles différences ?


Structure des silices

Les silices, utilisées en chromatographie liquide, se partagent en deux grandes catégories :

  • Les silices dont les particules sont irrégulières
  • Les silices dont les particules sont sphériques

Si les premières sont encore largement utilisées dans le domaine de la purification par chromatographie Flash ou à l’échelle industrielle, les secondes sont aujourd’hui le standard absolu pour l’analyse par (U)HPLC.

Mais quels sont leurs avantages ou leurs inconvénients ?
Pourrait-on indifféremment les intervertir dans leur usage respectif ?

Pour répondre, examinons d’abord la structure de la silice.
Chimiquement elle se compose d’atomes de silicium et d’oxygène. Chaque atome de silicium est tétravalent et lié à des atomes d’oxygène. La structure générale peut se représenter ainsi :

Composition chimique de la silice

 

Formes des silices

Qu’elles soient de forme irrégulière ou sphérique, les silices les plus courantes conservent cette structure chimique. Lors de leur synthèse, les procédés mis en œuvre conduisent à la réalisation de particules aux formes qui nous intéressent.
Les silices sphériques ressemblent à de petites billes poreuses alors que les particules irrégulières sont assimilables à de petits cailloux eux aussi poreux.

Formes des silices

 

Caractéristiques physico-chimiques

Ces silices se caractérisent par des valeurs chimiques et physiques qui leur confèrent des propriétés spéciales indispensables pour séparer des composés chimiques aux structures très variées.

Physiques

• Géométrie (irrégulière, sphérique)
• Granulométrie ou taille des particules (dp en µm)
• Diamètre des pores (Angström)
• Volume poreux (mL/g)
• Surface spécifique (m2/g)
  

Chimiques

• Nature et type du greffage
• % Couverture (% carbone, taux de couverture µmol/m2)
• Type de silice (pure ou non)

 

Empilement des silices dans une colonne

Une colonne Flash, (U)HPLC ou préparative remplie avec ces silices sera plus ou moins efficace selon la granulométrie des particules. On estime au mieux qu’un plateau (étage de séparation) ne peut être inférieur au diamètre de la particule de silice. En conséquence, plus la particule est petite, plus on a de « plateaux » dans la colonne. Dans l’exemple ci-dessous, quel que soit le modèle théorique, on déduit que des particules de 15 µm présenteront un empilement 2 fois plus compact que des particules de 30 µm.

Les silices irrégulières présentent, comme leur nom l’indique, des formes indéfinies pour lesquelles il est difficile de mesurer le diamètre moyen. De plus, leur empilement est désordonné et abouti à une compacité beaucoup plus faible que les silices sphériques. Enfin, ces silices contiennent en général de nombreuses « fines », c’est-à-dire de petites fractions qui peuvent passer à travers les frittés des colonnes.

L’arrangement des silices sphériques est bien supérieur aux silices irrégulières. L’écoulement des solvants à travers la colonne suit un chemin plus linéaire. Les familles d’analytes sont moins dispersées et sortent de la colonne dans un volume de solvant plus faible. On observe des pics plus fins et plus gaussiens.

Empilement de la silice

Conclusion

On comprend donc aisément l’intérêt des silices sphériques pour qui cherche une séparation plus efficace. Les silices de plus petites granulométries offrent la possibilité de réduire les longueurs des colonnes et donc le temps d’élution tout en conservant une bonne séparation.

Pour l’analyse et la quantification modernes, l’usage des silices sphériques est une évidence. Pour la purification, il faut trouver le meilleur compromis entre le prix de l’adsorbant et le rendement de séparation.

En savoir Plus :

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Chimie en continu : pourquoi le système PhotoSyn™ est idéal pour vos réactions chimiques ?


Logo Uniqsis

Le PhotoSyn™ est un module pour réaliser des réactions photochimiques en chimie continu et une montée en échelle.

PhotoSyn LED Photoreactor

PhotoSyn™ LED Photoreactor

Le PhotoSyn™ est équipé de 720 lampes puissantes, à intensité ajustable, il permet de travailler sur plusieurs sources lumineuses :

  • 365nm (UV) + 455nm (bleu)
  • (455nm) ; lumière bleue pour application photo redox
  • 455nm (bleu) + 555nm (vert) + blanc
  • Faisceau lumineux LED à façon

Combiné au Cold Coil™ ou au Polar Bear Plus Flow™, le PhotoSyn™ devient un système autonome de chimie en continu piloté par une l’interface facile d’utilisation sur laquelle est sélectionnée l’intensité et les différentes couleurs. Incluant un port RS232, elle peut aussi être contrôlée à distance.

Polar Bear Plus FlowFlowSyn ColdCoilInterface de pilotage
Polar Bear Plus Flow™FlowSyn ColdCoil™Interface de pilotage

 


Les boucles de synthèse et le micro réacteur peuvent être utilisés comme réacteur de synthèse.

Coil reactorMixer reactor block
Coil reactorMixer reactor block

 


La boucle de synthèse peut-être en PFA ou PFA chromé pour optimiser la réflection et couvre une gamme de volume de 2 mL à 52 mL. Le faisceau lumineux à LED est incurvé pour bien concentrer la lumière sur la boucle de synthèse et optimiser son irradiation.

Le micro réacteur en verre peut aussi être utilisé pour optimiser les mélanges des réactifs ou en tant que réacteur de synthèse. Dans ce cas, un mandrin très réfléchissant est utilisé pour assurer une pénétration maximale de la lumière à l’intérieur de ce réacteur.

La chaleur, dégagée par le faisceau lumineux, est dissipée grâce à une circulation d’eau ou de gaz comprimé dans la double enveloppe inclue dans la paroi du PhotoSyn™.

Un refroidissement par convection est également incorporé pour que la température de la boucle de synthèse soit contrôlée indépendamment par le Cold Coil™ ou par le Polar Bear Plus Flow™.

Le PhotoSyn™ a été conçu pour qu’il n’y ait aucune fuite de lumière et par conséquent, pas besoin d’un écran teinté ou étanche à la lumière.

Des verrouillages de sécurité sont également installés pour empêcher l’exposition accidentelle à une lumière si l’on tente d’enlever le module PhotoSyn™ durant une synthèse.

N’hésitez pas à nous contacter.

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Bénéficiez de notre service de fabrication à façon (colonnes & plaques) pour optimiser vos préparations d’échantillons SPE


A. Fabrication à façon sur demande

Nous vous proposons de fabriquer des colonnes et plaques multi-puits suivant vos spécifications.
Pour cela il suffit de nous faire parvenir une demande à :
interchrom@interchim.com
Fax : 04 70 03 82 60 – Tél. : 04 70 03 73 09

en précisant les points suivants :

  • le type d’adsorbant désiré
  • la masse d’adsorbant
  • la nature de la colonne, de la plaque ou du contenant
  • le volume de la colonne, des puits de la plaque ou du contenant
  • la nature et la porosité des frittés
  • la quantité des colonnes désirées

L’un de nos spécialistes vous contactera sous 48 heures pour valider la faisabilité du projet. Un contrat de confidentialité des données pourra être signé entre les deux parties.


Type d’adsorbant

Il peut être :

  • un adsorbant fabriqué par vos soins. Dans ce cas, il vous faut nous préciser sa nature et ses caractéristiques physiques ainsi que sa fiche de sécurité.
  • un adsorbant commercialisé et/ou fabriqué par une autre société
  • un adsorbant Interchim®

Masse d’adsorbant

Elle peut être comprise entre 15 mg et 70 g (fonction du volume de la colonne ou de la plaque choisie). La précision de nos pesées peut aller jusqu’à 1% près avec la possibilité d’obtenir un certificat de pesée pour les plaques 96 et 48 puits.

Nature de la colonne, de la plaque ou du contenant

Trois types de colonnes proposés :

  • Réservoir droit en polypropylène
  • Réservoir large capacité (LRC) en polypropylène
  • Réservoir droit en verre

3 Colonnes SPE sérigraphiées Plaques SPE Interchim

Deux types de plaques proposés :

  • Plaques 96 puits
  • Plaques 48 puits

Nous pouvons remplir tout autre type de contenant s’il est compatible avec nos systèmes de remplissage.

Volume de la colonne, de la plaque ou du contenant

  • 1 – 3 – 6 – 15 – 25 – 75 – 150 mL pour les tubes droits en polypropylène
  • 15 mL pour les réservoirs LRC en polypropylène
  • 6 mL pour les tubes droits en verre
  • 2 mL pour les plaques 96 puits en polypropylène
  • 5 ou 7 mL pour les plaques 48 puits en polypropylène

Nature et porosité des frittés

  • Polyéthylène pour les tubes droits en polypropylène et les réservoirs LRC
  • PTFE pour les tubes droits en verre
  • Polyéthylène pour les plaques 48 & 96 puits

B. Les contenants

ContenantsPhotoNatureVolumes disponiblesFrittés disponibles
Colonnes standardsSPE - Tube standardPolypropylène grade médical(1 – 3 – 6 – 15 – 25 – 75 – 150) mL20 µm Polyéthylène
Colonnes LRCSPE - Tube LRCPolypropylène grade médicalRobotic Large Capacité (LRC) 15 mL20 µm Polyéthylène
Colonnes GlassSPE - Tube verreVerre6 mL20 µm PTFE
CartouchesSPE - CartouchePolypropylène grade médicalType 300 – 600 – 900 mg20 µm Polyéthylène
Plaques 96 puitsSPE - Plaques 96 puitsPolypropylène grade médical2 mL avec des puits carrés20 µm Polyéthylène
Plaques 48 puitsSPE - Plaques 48 puitsPolypropylène grade médical5 mL avec des puits carrés20 µm Polyéthylène

 

C. La technologie Interchim® : Accurate Bed Technology™

Le procédé de fabrication Interchim® Accurate Bed TechnologyTM a été développé pour garantir une reproductibilité unique de lot à lot et de colonne à colonne.
Nos adsorbants SPE possèdent une distribution granulométrique optimisée et contrôlée de manière drastique.
Les quantités d’adsorbants sont introduites par pesée avec une précision de +/-1%.
Un certificat de pesée est délivré avec chacune de nos plaques 96 puits attestant de la masse réelle introduite dans chaque puits.
Il en résulte l’optimisation de la technique d’analyse et de l’interprétation des résultats.
Nos colonnes et plaques d’extraction SPE sont livrées dans un emballage PEHD/Al dédié au stockage longue durée.
Notre grande flexibilité et notre expérience dans le domaine du service nous permettent de satisfaire toute demande de fabrication à façon sans surcoût majeur.
Cette démarche permet d’apporter des solutions techniques nouvelles aux problématiques de nos clients et ainsi de leur faciliter le développement et l’optimisation de leur préparation d’échantillon.

Colonne SPE avec légendes

 

En savoir plus :

  • Retrouver nos consommable SPE et notre instrument, le SPE 6.25ws WorkStation sur notre site www.interchim.com
  • Consultez notre article (bientôt disponible) dédié à la méthodologie à suivre pour réussir vos préparations d’échantillons
  • Consultez notre article (bientôt disponible) dédié au développement et à l’optimisation d’une méthode SPE.
  • N’hésitez pas à nous contacter.
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Développement de méthode de purification des peptides en phase inverse


 

Introduction

La chromatographie en phase inverse est une technique très utilisée pour purifier les peptides. Cette technique doit sa popularité au fait que les temps de purification sont assez courts ainsi qu’aux efficacités atteintes. Les phases mobiles utilisées (principalement acétonitrile et eau) sont volatiles, ce qui facilite les étapes de concentration/lyophilisation.

Préparation de l’échantillon – Solubilité des peptides

La solubilité des peptides en solution dépend de plusieurs paramètres :

  • la séquence en acides aminés (si des résidus hydrophobes sont présents, cela diminue la solubilité en milieu aqueux)
  • la taille et la structure tertiaire des peptides. La solubilisation change, en fonction de la répartition des résidus
  • pourcentage en résidus chargés (il faudra appliquer des pH particuliers pour aider la solubilisation).

Il existe quelques règles à connaître pour la solubilisation en milieu aqueux :

  • Les peptides constitués de moins de 5 résidus sont généralement solubles, sauf si les résidus sont hydrophobes (Tryptophane, Isoleucine, Leucine, Phénylalanine, Méthionine, Valine ou Alanine).
  • Les peptides hydrophiles contenant plus de 25% de résidus chargés (Acide glutamique, Acide asparagique, Lysine, Arginine et Histidine) et moins de 25% de résidus hydrophobes sont généralement dissous dans un milieu aqueux, à condition que les résidus chargés soient distribués dans toute la séquence
  • Les peptides hydrophobes contenant de 50% à 75% de résidus hydrophobes peuvent êtres insolubles ou partiellement solubles dans des solutions aqueuses, même s’ils contiennent 25% de résidus chargés (généralement, ils sont solubles dans le TFA et l’acide formique)
  • Les peptides acides (residus Acide glutamique et Acide asparagique) et basiques (residus Arginine, Lysine, Histidine) sont plus solubles à pH neutre qu’à pH acide.
  • Les peptides très hydrophobes qui ont plus de 75% de résidus hydrophobes ne se dissolvent pas dans des solutions aqueuses. Il est préférable de faire un dépôt solide pour convenablement injecter ces peptides.
  • Les séquences peptidiques comportant une très grande proportion en Sérine, Thréonine, Acide glutamique, Acide asparagique, Lysine, Arginine, Histidine, Asparagine, Glutamine ou Tyrosine peuvent former un réseau de liaisons hydrogènes intermoléculaires et ont une tendance à former des gels en solution aqueuse quand ils sont concentrés. Ces peptides peuvent être traités comme des peptides hydrophobes.

Bien entendu, avant de passer l’échantillon sur la colonne, il est préférable de tester la solubilité d’une petite partie dans les conditions de début de méthode. Dans le choix des solvants, préférez un solvant facilement retirable par lyophilisation pour récupérer les solutés le plus pur possible.

 

Comment sont élués les peptides ?

Les interactions qui régissent les purifications de peptides en phase inverse sont entre la phase stationnaire et le squelette hydrophobe du peptide. Elles sont non dispersives et peu sélectives avec 2 mécanismes principaux qui sont de l’adsorption et du partage.

Les petits peptides (avec des masses molaires inférieures à 3kDa) sont élués par un mécanisme de partage tandis que les peptides plus gros sont élués principalement par un mécanisme d’adsorption. Cela revient à dire que les molécules à l’injection se « collent » contre la phase stationnaire, puis éluent dès que la proportion en solvant organique atteint un pourcentage défini.

Rétention en fonction de la fraction volumique d’acétonitrile

Rétention en fonction de la fraction volumique d’acétonitrile

 

Choix de la phase stationnaire

Choix de la phase stationnaire

Le choix de phase stationnaire dépend de la longueur des chaines peptidiques des solutés qui peut limiter les interactions par gêne stérique.

On utilisera de préférence une colonne C18 pour des peptides de tailles petites et moyennes, puis une colonne C8 pour des peptides plus importants et C4 pour des polypeptides.

Le second paramètre à prendre en compte est la porosité de la phase à employer. En effet, plus le peptide sera long, plus il sera difficile de le faire passer dans un pore de petite taille. Les peptides de 1 à 5kDa se sépareront avec une taille de pore de 100Å, ceux entre 5 et 20 kDa pourront être séparés avec une taille de pore de 200Å, et les polypeptides seront utilisés avec une taille de pore de 300Å.

Le dernier point concerne la taille des particules. Etant donnée la difficulté de certaines purifications, il n’est pas intéressant d’utiliser des tailles supérieures à 30µm.

 

Choix des conditions de solvants

Les solvants les plus utilisés sont l’eau et l’acétonitrile. L’acétonitrile permet d’augmenter l’élution des peptides. Le fait que ce solvant ne réponde pas trop en UV et soit facilement retirable, en fait un choix tout indiqué.

Il est courant d’utiliser en même temps de l’acide trifluoroacétique (TFA) comme agent d’appariement d’ion (cela permet de réduire les interactions ioniques entre les peptides et la phase stationnaire). La  forte volatilité du TFA en fait un bon élément car facilement retirable (attention toutefois à ce qu’il soit présent en même proportion dans les deux solvants). Son inconvénient est qu’il rendra difficile la détection MS. Il faut alors, soit baisser sa concentration (mais on dégrade le profil), soit utiliser un autre agent comme de l’acide formique par exemple qui permet la détection.

Pour des applications avec des composés très hydrophobes, il est possible d’utiliser de l’isopropanol, solvant avec un pouvoir éluant plus important. Il présente l’avantage, non négligeable, de garder l’activé biologique des peptides. Ce solvant est principalement utilisé pour des polypeptides sur colonne C4, 300Å.

Généralement on commence la méthode avec 5% de solvant fort pour augmenter la force éluante de 1%/min, ce qui permet d’obtenir de bonnes résolutions.
Pour des applications avec des peptides polaires, il faut utiliser un mode HILIC, en démarrant avec 95% d’acétonitrile pour tendre vers 85%.

 

Influence des paramètres

Plusieurs paramètres peuvent permettre d’optimiser les purifications :

  • Gradient : Comme expliqué dans la partie mécanisme, les peptides (>3kDa) sont élués par un mécanisme d’adsorption. Un gradient par palier pour l’élution peut s’avérer utile.
  • Réactif d’appariement d’ion. Le TFA est le plus utilisé mais il est possible d’utiliser du FA, PFPA, HFBA (agent anionique) ainsi que du TEA, TBA (agent cationique) qui pourront alors aider à la séparation de peptides possédant des résidus Basiques.
  • Température : la température de la colonne est un critère d’optimisation. Il permet de diminuer la viscosité du solvant (permettant une baisse significative de la contre-pression) tout en permettant de diminuer le temps de sortie des produits. Attention toutefois à ne pas dégrader les solutés avec une température trop élevée.
  • Débit : Si pour les petites molécules, le débit est un critère d’optimisation permettant de gagner du temps avec une petite perte de résolution, c’est le contraire pour les peptides plus importants : une augmentation du débit entrainera une dégradation du profil de la purification.

Courbe de Van Deemter

Pour les peptides de faible masse molaire, il existe un débit optimal
(courbe de Van Deemter….)

Pour les peptides de masse molaire élevée, l’augmentation du débit altère le profil des pics. Cela peut même provoquer des dédoublements de pic si le débit est trop élevé.
Tyrosine : 181 g/mol
Myoglobin : 17 000 g/mol
Albumin : >60 000 g/mol

 

Troubleshooting

Si pas de rétentionRétention trop grande ou pas d’élutionSélectivité insuffisante
Vérifier le solvant de l’échantillon (la force éluante doit être inférieure ou égale à la force éluante de la phase mobile de début de run)

Vérifier la concentration en réactif d’appariement d’ions (généralement le réactif est volatil)

Vérifier le conditionnement de la colonne (éviter de laisser la colonne sous plus de 95% de solvant organique)

Diminuer la concentration de solvant organique

Diminuer la pente du gradient
Vérifier la nature et la concentration en réactif d’appariement

Augmenter la concentration en solvant organique

Augmenter la température

Changer de colonne (tester une colonne C8 ou C4 si C18 ne fonctionne pas)
Modifier le réactif d’appariement d’ion
Modifier la pente du gradient

Modifier le solvant organique (par exemple mélange acétonitrile/IPA, 90/10 max, en remplacement de l’acétonitrile seul pour les peptides très hydrophobes)

Changer de colonne (C18, phényle, C8, C4)

 

En savoir plus :

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Analysez les nitrosamines dans les médicaments contre l’hypertension (retrait d’un grand nombre de lots)


1. Les nitrosamines dans le viseur des agences de médicaments

Les agences des médicaments françaises, américaines, …, ont demandé le retrait d’un grand nombre de lots de médicaments à base de Sartan, suite à la présence éventuelle d’une impureté.
N-Nitrosodimethylamine (NDMA)En effet, l’impureté incriminée est la N-Nitrosodiméthylamine (NDMA).  Cette substance est classée comme « probablement cancérogène » chez l’homme.
Les nitrosamines peuvent être générées lors de réactions chimiques utilisées pour la fabrication des inhibiteurs des récepteurs de l’Angiotensine II (Sartan).

2. L’application proposée par la FDA pour l’analyse de l’impureté N-Nitrosodiméthylamine (NDMA)

Logo FDALa FDA (Food and Drug Administration) a diffusé une application qui recommande l’utilisation d’une colonne GC polaire DB-WAX UI fabriquée par notre partenaire Agilent pour mener à bien les analyses de N-Nitrosodiméthylamine (NDMA). Pour information, cette application que vous pourrez télécharger plus bas nécessite également l’utilisation d’un passeur automatique Head Space et d’un détecteur GC/MS.

3. Présentation de la colonne GC d’Agilent recommandée et ses avantages indéniables :

Colonne Agilent DB-WAX UIA l’instar des colonnes GC de la même gamme, la colonne DB-WAX UI utilisée pour l’analyse de la molécule N-Nitrosodiméthylamine dans l’application de la FDA offre une excellente inertie avec une forme de pic plus fiable et une meilleure durée de vie que les colonnes WAX concurrentes.
 
Cette gamme de colonnes innovantes présente d’autres avantages remarquables, tels que :

•Passer moins de temps à résoudre les anomalies et à refaire les analyses :

Les colonnes GC DB-WAX UI offrent une forme de pic et une reproductibilité excellente, des limites de détection plus basses et une meilleure stabilité des temps de rétention.

•Économiser de l’argent sur les colonnes :

La durée de vie élevée de l’inertie permet une meilleure résistance à des cycles thermiques répétés.

•Arrêter de préqualifier les colonnes :

Des tests d’inertie spécifiques garantissent une performance immédiate pour toute colonne GC DB-WAX UI.

•Mettre en œuvre rapidement :

Les colonnes GC DB-WAX UI ont la même sélectivité que les colonnes GC Agilent J&W DB-WAX. Ce qui veut dire que vous pouvez facilement passer à la performance Ultra Inert sans recréer les bibliothèques de composés existantes.

Performance DB-WAX UI

Excellente inertie, même après 50 heures d’exposition à 250 °C :

Le mélange test QC DB-WAX Ultra Inert contient des composés tels que du décane, de l’acide propionique, de l’acide 2-éthylhexanoïque et de l’éthyle maltol – pour assurer une inertie constante lors de vos analyses de composés polaires les plus exigeantes.

 

En savoir plus :

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Comment développer et optimiser une méthode SPE (Extraction sur Phase Solide)


Pour développer une méthode SPE robuste, reproductible et répétable, il est fondamental de choisir au mieux :

  • Le type d’adsorbant (silices ou polymères)
  • La nature de l’adsorbant
  • La masse d’adsorbant
  • Le volume du contenant

Ces quatre paramètres sont essentiels pour obtenir :

  • Une sélectivité de purification intrinsèque à l’échantillon
  • Une capacité de charge nécessaire et suffisante
  • Un facteur de pré-concentration important
  • Un rendement d’extraction optimum

Mettre en œuvre une purification SPE nécessite un minimum de connaissances sur la matrice, les impuretés, les analytes à extraire qui seront par la suite analysés. Les kits de développement de méthodes sont des outils performants et pertinents qui permettent d’apprécier rapidement le type d’adsorbant à utiliser ainsi que la sélectivité qu’il apporte pour réaliser vos extractions.
Pour plus d’informations, notre service s’engage à vous apporter le meilleur support ainsi que des solutions individualisées.

 

Protocole indicatif pour le développement de méthodes SPE sur Polymère

Protocole indicatif pour le développement de méthodes SPE sur Polymère

*Pré-traitement de l’échantillon (Soxhlet, Extraction Lig/Liq (LLE), Extraction Liquide/Solide (SLE), Filtration, Précipitation de protéines…)

Pré-traitement de l’échantillon :

Différents protocoles peuvent être nécessaires avant de déposer l’échantillon sur une colonne SPE (filtration, extraction Liquide/Liquide, extraction avec un appareillage de type Soxhlet). Ces étapes dépendent de la nature de l’échantillon (principalement solide ou liquide).


Conditionnement  :

On utilise principalement des solvants organiques de type Methanol, Acétonitrile, Dichlorométhane. Pour les échantillons aqueux, une deuxième étape de conditionnement avec de l’eau peut s’avérer nécessaire.


Dépôt de l’échantillon.

Lavage :

Le lavage élimine les composés interférents de la matrice qui auraient une légère affinité avec la phase stationnaire de la colonne SPE.

  • Un lavage légèrement acide élimine les acides faibles présents dans le milieu.
  • Un lavage légèrement basique élimine les bases faibles présentes dans le milieu.


Elution :

Les composés d’intérêt sont désorbés de la phase stationnaire.

  • Un solvant organique (Methanol, Acétonitrile, Dichlorométhane) est généralement utilisé pour l’élution des composés par ordre de polarité décroissante (ici phase inverse).
  • En échange d’ions il faut se placer à un pH correspondant à la zone dans laquelle l’analyte est sous forme neutre.

En savoir plus :

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Extraction sur phase solide : la méthodologie à suivre pour réussir vos préparations d’échantillons


A. Introduction à l’extraction sur phase solide (SPE)

Partie intégrante d’une analyse, la préparation d’échantillons a considérablement évolué ces dernières années. C’est sans aucun doute l’étape la plus importante du processus analytique. Certaines études montrent que la préparation d’échantillons représente en général environ 60% du temps de travail d’un technicien de laboratoire et qu’elle est l’une des principales sources d’erreurs entachant le résultat de l’analyse. Avec ce constat, on comprend mieux pourquoi une bonne préparation d’échantillons influe directement sur la limite de détection, la reproductibilité et la répétabilité de l’analyse. Son impact sur la qualité de l’analyse est fondamental.

La multitude de matrices à traiter (sang, plasma, eaux, organes, viandes, poissons, légumes,…) nécessitent l’emploi de techniques variées : filtration, dialyse, extraction liquide – liquide, extraction sur phase solide (SPE). Parmi celles-ci, l’extraction en phase solide est certainement la technique qui a le plus évolué dans la dernière décennie. Elle est aujourd’hui présente dans la plupart des laboratoires et permet de réaliser des purifications et une concentration efficaces de l’échantillon avant l’analyse HPLC, HPLC/MS, GC ou GC/MS. Le niveau de qualité requis pour les produits de SPE s’est donc renforcé. Ainsi, de nouvelles innovations technologiques telles que les polymères à hautes surfaces spécifiques, les polymères échange d’ions et les silices sphériques pures sont devenues incontournables.

Rendement, capacité, sélectivité, reproductibilité sont les principales vertus qu’attendent les analystes de leurs méthodes de traitement d’échantillon. Grâce à leur expérience, nos laboratoires ont développé la marque Upti-Clean®, supports silices sphériques purs ainsi que les marques Atoll™, PolyClean™ et BioP™, polymères sphériques ultrapurs.
Ces gammes de produits répondent parfaitement aux besoins des méhodes modernes et concourent à les rendre plus fiables, plus reproductibles et plus robustes.

Technical Tip
  • Vérifier la miscibilité des solvants qui seront utilisés
  • Toujours laisser le niveau du solvant au dessus de l’adsorbant pour maintenir son activation.
  • Pour des silices greffées avec un échangeur d’ions, activer avec du méthanol, de l’eau puis avec de l’eau tamponnée au pH souhaité.

 

B. Méthodologie générale SPE

Tous les adsorbants remplis dans des cartouches, colonnes ou plaques 96 puits sont à usage unique (exceptées les colonnes de trapping « on-line » montées en ligne sur un système HPLC). L’utilisation d’appareil est recommandée pour la percolation des différents solvants (appareil à vide, appareil à pression positive, seringues).

Le choix de la colonne est défini par le volume de l’échantillon, sa concentration en analytes et les types d’échanges recherchés. Dans l’environnement, des volumes de plusieurs centaines de millilitres peuvent être nécessaires pour une bonne pré-concentration (ex. : polluants organiques). En revanche, dans l’industrie pharmaceutique, le volume des échantillons à purifier n’est que de quelques millilitres. L’adsorbant choisi doit avoir une excellente affinité pour les composés cibles. Il doit également présenter un minimum d’affinité avec les interférents de la matrice.
Un protocole SPE se décompose en plusieurs étapes.

1. Conditionnement puis Equilibration

Conditionnement puis EquilibrationÉtape d’activation avec un solvant organique ou un mélange de solvants pour permettre l’élimination des contaminants et favoriser les échanges dans l’adsorbant. Cette étape permet également une meilleure mouillabilité des frittés.

L’hexane, le cyclohexane ou le dichlorométhane sont des solvants régulièrement utilisés en mode « phase normale » pour conditionner la silice vierge ou la silice greffée aminopropyle (R-NH2), dihydroxypropyle (R-R’OH-R »OH), cyanopropyle (R-CN), …
En mode « phase inverse », pour des silices greffées C18, C8, C2, phényle, cyclohexyle, on emploie couramment le méthanol voire l’acétonitrile.

2. Introduction de l’échantillon

SPE-Introduction de l'échantillon

L’échantillon est déposé sur la partie supérieure du lit de l’adsorbant. Les impuretés n’ayant aucune affinité avec l’adsorbant ne sont pas retenues. D’autres le sont plus ou moins fortement que les composés d’intérêts. Pour apporter un maximum d’efficacité à la purification, la vitesse d’écoulement de l’échantillon doit être contrôlée.


Les valeurs expérimentales des débits observés pour des granulométries d’approximativement 50 µm sont comprises entre :

  • 0,7 – 1 mL / min pour des colonnes de 1 mL
  • 2 – 3 mL / min pour des colonnes de 3 mL
  • 5 – 7 mL / min pour des colonnes de 6 mL
  • 7 – 10 mL / min pour des colonnes de 15 mL
  • 10 – 15 mL / min pour des colonnes de 25 mL
  • 0,6 – 1,1 mL / min pour des plaques 96 puits
  • 4 – 5 mL / min pour des cartouches fermées

Lors des premiers essais, il est impératif de vérifier que tous les composés d’intérêts de l’échantillon ont été fixés sur l’adsorbant, ce qui implique d’analyser la fraction de percolation. En échange d’ions, le pH de l’échantillon doit être identique au pH du tampon utilisé lors de l’étape d’activation de l’adsorbant.

La percolation des échantillons visqueux à travers une colonne peut être facilitée en utilisant des adsorbants de 90 à 140 µm. La capacité d’échange et la sélectivité ne sont pas affectées.

3. Lavage > Elimination des produits secondaires

SPE-Lavage > Elimination des produits secondairesÉtape qui permet l’élimination d’impuretés possédant moins d’interactions avec l’adsorbant que le ou les composés d’intérêt. D’autres solutions (solvants ou mélanges de solvants) peuvent être utilisées pour une efficacité plus importante. Elles doivent avoir le plus d’affinité possible avec les impuretés et le moins possible avec les composés d’intérêt pour ne pas les éluer à l’issue de cette étape (Attention à la polarité et au pH des solvants de lavage).

4. Séchage > Elimination des traces de solvant de lavage

SPE-Séchage > Elimination des traces de solvant de lavageFaire circuler de l’air pendant 2 à 5 minutes à travers la cartouche pour évaporer les traces de solvant de lavage. Cette étape améliore le rendement d’extraction.

5. Elution > 100% des composés élués par le solvant

SPE-Elution > 100% des composés élués par le solvantÉtape qui consiste à récupérer 100 % des composés d’intérêt présents sur l’adsorbant. Le solvant ou mélange de solvants utilisé doit avoir le maximum d’interactions avec les analytes et le moins possible avec les autres interférents qui peuvent rester adsorbés. Le solvant d’élution doit être le plus efficace possible, son volume doit être faible de manière à obtenir un facteur de pré-concentration très important. Un adsorbant à faible diamètre de particules (ex : 30 ou 50 µm) garantira un volume d’élution plus faible qu’un adsorbant de granulométrie plus grande (ex : 90, 140 µm). Par contre la vitesse d’écoulement des fluides sera plus lente avec un risque potentiel de colmatage pour les échantillons sirupeux.

6. Séchage

Si nécessaire, l’éluat peut être séché avec du sulfate de sodium anhydre pour éliminer les éventuelles traces d’eau.

7. Concentration

Le but de cette étape est de concentrer les composés d’intérêt dans la fraction d’élution. Elle est généralement réalisée par évaporation d’une partie du solvant. Le concentré obtenu est soit directement utilisable, soit repris dans un solvant d’analyse. Une fois optimisées, ces étapes garantissent une analyse plus sensible (augmentation de la concentration des composés d’intérêt), plus reproductible et résolutive (élimination des impuretés qui peuvent modifier la robustesse de l’analyse).

 

C. Définition du « volume lit »

Pour les étapes de conditionnement, de lavage et d’élution, les volumes théoriques sont de 2 à 3 fois le volume de l’adsorbant ou « volume lit » soit :

  • Pour 100 mg de silice 60 A 50 µm : ~120 µL
  • Pour 500 mg de silice 60 A 50 µm : ~ 600 µL
    Pour 100 mg de polymère : ~ 180 µL

SPE-Définition du "volume lit"

Une masse d’adsorbant trop élevée induit une élution incomplète des composés d’intérêt ou une dilution de l’échantillon par un volume d’élution trop important. Une masse d’adsorbant trop faible induit une rétention incomplète des composés d’intérêt que l’on retrouve dans la fraction de percolation ou dans le solvant de lavage. Ces deux situations conduisent à des taux de récupération plus faibles que prévus.

1. Choix de l’adsorbant SPE ?

Quel que soit l’échantillon à purifier (qu’il soit issu de l’environnement, du domaine pharmaceutique, du domaine cosmétique, de l’agrochimie, etc. …), il est fondamental de choisir son adsorbant d’extraction sur phase solide de façon précise.
Le choix de cet adsorbant permettra de définir une sélectivité spécifique aux composés d’intérêt ainsi qu’une capacité de charge suffisante à l’entière adsorption de ceux-ci.

On rencontre en général deux grandes familles :

  • Les silices
  • Les polymères

Ces deux familles possèdent des caractéristiques très différentes.
Leurs applications, avantages et inconvénients sont divers et variés.

2. Polymères

  • Très stables chimiquement, ils résistent le plus souvent à un pH compris entre 1 et 14.
  • Faiblement sélectifs comparés aux silices greffées (exceptés les polymères échange d’ions).
  • Ils possèdent une capacité de charge bien supérieure aux silices traditionnelles et permettent la purification d’un très grand nombre de molécules ou de familles de molécules quelle que soit la matrice (eaux, huiles, plasma, urines, …)

La masse de composés adsorbables peut aller jusqu’à 30% de la masse du polymère contenue dans la colonne. Il est donc possible de réaliser le même travail de purification avec une quantité de polymères 2 à 3 fois moindre que celle d’une silice. Le volume d’élution est beaucoup plus faible, ce qui conduit à une concentration plus importante, une durée de l’évaporation réduite et finalement une préparation d’échantillon plus rapide.

AdsorbantMasse d’adsorbantSurface SpécifiqueCapacité de charge
Silices500 mg500 m2/g5 – 50 mg
Polymères500 mg800 m2/g15 – 100 mg
Polymères500 mg1500 m2/g15 – 150 mg

 

3. Silices

  • Stabilité chimique moins importante que les polymères, elles sont stables à un pH compris entre 2 et 7,5.
  • Beaucoup plus sélectives que les polymères avec une capacité de charge moins importante du fait de leur plus faible surface spécifique (de l’ordre de 3 à 10% de la masse d’adsorbant), les silices restent toujours des adsorbants de référence très utilisés.

On distingue 4 familles de silices identifiables par leur mode de fonctionnement ainsi que par leur sélectivité :

a. Silices pour mode « Phase inverse »

En mode « Phase Inverse », les greffons hydrophobes fonctionnent selon les interactions de type Van der Walls. La purification permet un isolement de familles de composés apolaires ou faiblement polaires.
L’ajout de tampon est préférable lorsque les composés sont ionisables (acides, bases).
Les phases apolaires non post-silanisées (non end capped) donnent, avec les groupements silanols superficiels, des interactions polaires supplémentaires qui peuvent améliorer la rétention des composés contenant des fonctionnalités polaires.
Pour un même éluant, plus la chaîne carbonnée est courte, plus la rétention d’un composé est faible.
Pour les composés aromatiques, le greffage phényl présente de meilleures interactions.
Le méthanol ou l’acétonitrile sont des solvants d’élution régulièrement utilisés.

b. Silices pour mode « Phase Normale »

Le mode « phase normale » reste un compromis très intéressant pour la purification de molécules ou familles de molécules dont la structure présente un grand nombre de fonctions polaires. Le choix du solvant est très important et influe directement sur le type d’interaction mis en oeuvre pour la purification (un solvant apolaire favorise les interactions polaires entre l’adsorbant et les composés).

  • Le greffage cyano (CN) peut être utilisé soit en « phase normale » pour l’extraction de composés polaires soit en « phase inverse » pour les molécules moyennement polaires.
  • La silice greffée Diol se présente comme une très bonne alternative à la silice vierge pour l’extraction de composés polaires (liaisons hydrogène).
  • Phase mixte, la silice amino (NH2) peut s’utiliser comme un échangeur d’anions faible (pour les acides très forts) ou comme un adsorbant polaire qui peut interagir avec les groupements fonctionnels -OH, -NH, -SH-, …

c. Silices pour mode « Echange d’ions »

En mode « échange d’ions », le mécanisme de rétention est l’interaction ionique. L’extrémité du greffon de l’adsorbant crée une attraction forte avec le ou les composés de l’échantillon possédant une ou des fonctions ionisables antagonistes. L’interaction des phases échangeuses d’ions dépend essentiellement du pH et de la force ionique du contre-ion. La force de la liaison sera d’autant plus importante que l’acide et la base qui s’apparient sont forts, ce qui peut être problématique pour l’étape d’élution et pour l’obtention d’un bon taux de recouvrement.

C’est pourquoi il existe différents greffons échange d’ions :

  • Les phases échangeuses d’anions (SAX) sont généralement une amine quaternaire très forte. Elles sont utilisées pour extraire les acides faibles portant une ou des charge(s) négative(s).
  • Les phases échangeuses de cations (SCX) ayant une fonctionnalité sulfonique sont utilisées pour extraire tous les composés basiques faibles portant une ou des charge(s) positive(s).
  • Les phases échangeuses d’anions, (DEAE, DEA, NH2,…) sur une base d’amine moins forte que le SAX, sont utilisées pour extraire les acides forts portant une ou des charge(s) négative(s).
  • Les phases échangeuses de cations (WCX) sont fonctionnalisées par un acide carboxylique et sont utilisées pour extraire tous les composés basiques forts portant une ou des charge(s) positive(s).

d. Silices pour mode « Mixed Mode »

Une des techniques les plus sélectives des adsorbants silices greffées est celle du « mode mixte » ou « mixed mode ». Le double greffage (échange d’ions et chaînes carbonées hydrophobes) apporte de nouvelles sélectivités. Les composés d’intérêt, qui doivent impérativement posséder une fonction acide ou basique, sont retenus sur le greffage échange d’ions. Un premier lavage puissant faisant intervenir le pH permet d’éliminer les impuretés ionisables. Il est ensuite possible d’éliminer les autres impuretés retenues sur le greffage hydrophobe par un solvant organique. Cette technique est très utilisée pour l’extraction de composés basiques (médicaments, drogues et métabolites) dans les fluides biologiques (sang, plasma, urines, …).


Comme en « échange d’ions », il existe différents greffons spécifiques aux composés d’intérêt :
Les phases « mixed mode » (RP/SCX) sont constituées d’un acide fort (sulfonique) et d’un greffon hydrophobe. Elles sont utilisées pour extraire les bases faibles portant une ou des charge(s) négative(s).

  • Les phases « mixed mode » (RP/SAX) sont sur une base d’amine quaternaire et de greffons hydrophobes. Elles sont utilisées pour extraire les acides faibles portant une ou des charge(s) négative(s).
  • Les phases « mixed mode » (RP/WCX) sont constituées d’un acide faible (carboxylique) et de greffons hydrophobes. Elles sont utilisées pour extraire les bases fortes portant une ou des charge(s) négative(s).
  • Les phases « mixed mode » (RP/NH2) sont sur une base d’amine faible et de greffons hydrophobes. Elles sont utilisées pour extraire les acides forts portant une ou des charge(s) négative(s).

SPE-Silices "Mixed Mode"

4. La répartition en fonction du pH de la proportion acide/base conjuguée d’un composé ionisable acide (rouge) et basique (bleu) en solution

SPE-Repartition en Fonction du pH

 

Technical Tip
Les méthodes d’extraction SPE basées sur les modes « Échange d’Ions » et « Mixed Modes » sont relativement complexes à mettre en oeuvre.
Au niveau de l’échantillon, les acides et les bases en solution doivent se présenter sous leurs formes ionisées pour développer des interactions avec l’adsorbant.
Pour rendre reproductibles et répétables les taux de récupération, il est indispensable de tamponner l’échantillon et l’adsorbant au pH optimum.
Ex : Pour la zone de pH comprise entre 5,6 et 8,6 dans l’exemple ci-joint, la totalité des composés acides (pKa 3,6) et basiques (pKa 10,6) s’apparient en formant une liaison ionique forte.

 

5. La sélectivité relative des contre ions

Un contre-ion est une espèce chimique ionique capable de s’apparier sur un échangeur d’ions. En fonction de sa concentration en solution et de son affinité avec l’échangeur, il améliore l’efficacité des étapes de lavages et d’élutions.

SPE-Sélectivité relative des contre ions

En savoir plus :

  • Retrouver nos consommables SPE et notre instrument, le SPE 6.25ws WorkStation sur notre site www.interchim.com
  • Consultez notre article (bientôt disponible) dédié au développement et à l’optimisation de méthode d’extraction sur phase solide.
  • Consultez notre article (bientôt disponible) dédié à notre service de fabrication à façon (colonnes & plaques).
  • N’hésitez pas à nous contacter.
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Analyse directe de protéines avec Advion Touch Express Open port sampling interface (OPSI)


1. Principe de fonctionnement du Touch Express d’Advion

Le Touch express est un nouveau système d’introduction d’échantillon pour l’analyse en spectrométrie de masse utilisant une technique développée par Gary Van Berkel et Vilmos Kertesz du laboratoire national d’Oak Ridge: Open Port Sample Interface (OPSI).

Ce système d’introduction d’échantillon couplé à un spectromètre de masse expression CMS Advion fournit rapidement (en moins de 30 secondes) un résultat à partir d’une surface, d’un solide ou d’un liquide.

Le système OPSI est constitué d’un port ouvert balayé en continu par un solvant envoyé ensuite directement dans la source electrospray (ESI) du spectromètre de masse.

L’analyse est effectuée par simple contact d’un échantillon sur ce port ouvert.

OPSI PALLab

Figure 1 : Touch Express couplé au spectromètre de masse expressionL CMS.
L’analyse est réalisée avec une source ESI en mode positif en utilisant de l’acétonitrile
avec 0,1% d’acide formique comme solvant de make-up à un débit de250µL/min.

 

Menisque du solvant sur port ouvert

Schéma OPSI

1. Solvant make-up pompe (250µL/min)
2. Envoi de l’échantillon vers la source ESI par Effet Venturi

Figure 2 : Fonctionnement de l’OPSI.
Le solvant de make-up est envoyé sur le port ouvert où il forme un ménisque
avant d’être envoyé vers la source d’ionisation sous l’effet Venturi
du gaz de nébulisation.

 

2. Exemple d’application avec leTouch Express OPSI couplé à un spectromètre de masse expressionL CM

Dans l’exemple ci-dessous, le Touch Express OPSI est couplé à un spectromètre de masse expressionL CMS pour démontrer la rapidité d’analyse de protéines : 2µL de myoglobin (cheval) ainsi que 2µL de cytochrome C (cheval) à une concentration de 1mg/mL dans 10mM d’acétate d’ammonium sont déposés directement sur le port avec une pointe de pipette.

Spectre Myoglobin

Figure 3 : analyse de la myoglobine avec le Touch Express OPSI
3a. Spectre de masse de la myoglobine
3b. masse déconvoluée et non chargée de la myoglobin

 

Spectre_Cytochrome

Figure 4 : analyse du cytochrome C avec le Touch Express OPSI
4a. Spectre de masse du cytochrome C
4b. masse déconvoluée et non chargée du cytochrome C

 

Résultats :

Après l’analyse de l’échantillon, une déconvolution de charge est effectuée grâce au logiciel Advion Data Express qui calcule automatiquement la masse de la protéine non chargée à partir du spectre de la biomolécule obtenue. Les spectres de masse et la masse déconvoluée et non chargée de la myoglobine et du cytochrome C sont présentés fig 3 et 4.

Un total de 14 ions de la myoglobin est détecté (fig 3a). La masse non chargée de la myoglobine est de 16 951.2 (fig 3b).
De même pour le cytochrome C un total de 12 ions est détecté. La masse non chargée du cytochrome C est de 12 359.3 (fig 4b).

 

Conclusions :

Le Touch Express OPSI fournit :

  • Une analyse directe par contact de l’échantillon (surface, solide ou liquide)
  • Une analyse rapide < 30s

Le tout sans aucun risque de contamination puisque le port est continuellement rincé par le solvant de make-up.

 

En savoir plus :

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SPE, HPLC et Flash Prep LC : les différences entre ces 3 processus séparatifs


1. Les différences entre SPE, HPLC et Flash Prep LC

SPE (pour Sample prep Extraction)

  • Processus séparatif discontinu
  • Analytes de polarités et structures différentes
  • Echantillons de mélanges complexes dans lesquels se trouvent un grand nombre de solutés parasites perturbant la séparation

LC (pour Liquid Chromatography)

  • Processus séparatif continu
  • Analytes de polarités et structures voisines
  • Solutions injectées relativement propres

LC prep & Flash

  • Processus séparatif continu
  • Analytes de polarités et structures voisines
  • Mélanges à purifier plus ou moins propres
 Chromatographie
(HPLC, prep LC, Flash)
Extraction
(SPE,SLE)
Processus séparatifContinuDiscontinu
Solutés dans la colonneToujours en mouvementBloqués puis décrochés
Composition phase mobileSoit constante (analyse isocratique)
Soit changée continûment (gradient)
Changée pas à pas
Type de séparationChromatographie d’élutionChromatographie frontale
Volume de la colonne occupé:
par les analytes
par la seule phase mobile
1 à 2 % (HPLC)
99-98 %(HPLC)
100 %
0 %
Constituants de l’échantillonSolutés de polarités voisinesSolutés de polarités différentes
UtilisationRéutilisable« One Shot »
Coût de fonctionnementMoyen à élevéFaible
Coût de l’appareillageElevéFaible

 

2. SPE & HPLC > Définitions

SPE

Elle sert à pré-séparer des solutés de structures différentes et à les recueillir dans un minimum de solvant. D’où les longueurs très courtes des cartouches de SPE. Pour que la SPE sépare les solutés d’intérêt, on doit travailler avec des facteurs de sélectivité supérieurs à 4. Le mode step gradient facilite la séparation. La SPE est une chromatographie fonctionnant à très grande sélectivité.

HPLC

Compte tenu de l’efficacité des supports de petit diamètre de particules et des longueurs de colonnes usuelles, on percolera la colonne en continu par la phase mobile et on séparera facilement des solutés avec un facteur de sélectivité de 1,05.
En conclusion, les lois permettant de choisir la phase mobile sont les mêmes en LC et en SPE mais elles seront utilisées selon des critères différents.

 

3. Caractéristiques des phases stationnaires utilisées en HPLC, Flash et SPE

 HPLCFlashSPE
Diamètre des particules1,7 à 10 µm15 – 50 µm30 à 140 µm
Compacité du remplissageForte15 – 50 µmForte
Effets extra colonneFaibles (si optimisés)– – –Forts
Longueur de colonne3 à 30 cm5 à 50 cm~ 1 à 2 cm
Efficacité (Nombre de plateaux)5000 à 60001000- 5000~ 10 à 50
Sélectivité nécessaireFaibleMoyenneForte
Polarité des analytesPeu différentePeu différenteTrès différente
Diamètre des pores60 – 150 Å60 – 150 Å60 – 150 Å
Surface spécifique50 – 450 m2/g50 – 450 m2/g500 – 1500 m2>/g

Réalisée en collaboration avec l’Université Paris-Sud, Pr A. Tchapla & Dr S. Héron, LETIAM, IUT d’Orsay, Orsay, France.

 

4. Influence de la taille des particules

En SPE, le diamètre des particules varie de 30 à 140 μm, les longueurs de lit de 1 à 2 cm.

En HPLC, le diamètre des particules est compris entre 1,7 et 5 μm, les longueurs classiques de colonne entre 5 et 25 cm.

En prep LC et Flash, le diamètre des particules varient de 10 à 50 μm, les longueurs des colonnes de 5 à 50 cm.

Pour une même phase stationnaire, si seul le diamètre de particules diffère (mêmes solutés, même phase mobile, même température) :

  • la rétention et la sélectivité ne seront pas affectées
  • la résolution sera changée (les longueurs des colonnes affectent également le nombre de plateaux).
Efficacité théoriqueØ des particulesApplications
5 000 plateaux/m50 µmFlash purification
SPE
20 000 plateaux/m15 µmFlash purification
SPE
prep LC
33 000 plateaux/m10 µmprep LC
80 000 plateaux/m5 µmAnalytique
130 000 plateaux/m3 µmAnalytique
180 000 plateaux/m2,2 µmAnalytique
UHPLC
220 000 plateaux/m1,7 µmUHPLC

Classiquement une colonne d’HPLC analytique de longueur 25 cm, remplie de particules de 5 µm développe une efficacité de l’ordre de 20 000 plateaux en routine. Une cartouche de SPE de longueur 1,25 cm remplie de particules de 50 µm développe une efficacité de l’ordre de 50 plateaux.

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Nano-Anticorps, de nouveaux outils pour l’analyse des protéines, les immunoessais et la thérapie médicamenteuse


Un peu d’histoire

Camel

A la fin des années 80, au cours de travaux pratiques d’extraction d’immunoglobulines, deux étudiants utilisèrent des échantillons de sérums de dromadaires congelés à la place d’échantillons humains qu’ils craignaient être contaminés par le VIH. Quelle ne fût pas leur surprise de visualiser en plus des habituelles immunoglobulines un groupe d’anticorps plus petits qui ne correspondait à rien de connu.

Ne croyant pas un des anticorps variants ou dégradés mais à des anticorps à part entière, deux chercheurs entreprirent de les caractériser. Ils mirent au jour des anticorps dépourvus de chaîne légère et possédant un seul domaine de reconnaissance antigénique, constituant une nouvelle classe, car mis en évidence chez d’autres espèces de camélidés dont les Lamas et les Alpagas.

 

Structure des Nanocorps

Les anticorps de camélidés sont appelés nanocorps (de l’anglais Nanobody), ou anticorps à chaîne lourde (hcAb). En effet, ils sont très petits, car composés d’une seule chaîne lourde. Ils sont dépourvus de chaîne légère ce qui implique que le fragment Fab (fragment antigen binding) de ces anticorps est réduit à un seul domaine variable (VHH : domaine variable des anticorps à chaîne lourde). Ils ne pèsent qu’environ 15 kDa et n’occupent que 4 nm de long et 2.5 nm de large, bien moins que les anticorps conventionnels (150-175KDa) et leurs fragments, Fab (~50 kDa) et scFv (~25 kDa) !

Structure des Nanocorps

Avantages des Nanocorps

La plupart des avantages résultent de leur petite taille :

  • Ces nanocorps sont capables d’atteindre des épitopes cryptiques des cibles, souvent inaccessibles aux anticorps traditionnels 10x plus gros.
  • La stabilité thermique et chimique des nanocorps est bien meilleure que celle des anticorps traditionnels. La solubilité est aussi améliorée. Ce qui permet leur emploi en conditions extrèmes, et de les délivrer in vivo par voie orale et peut-être oculaire, en plus de l’injection intraveineuse et sous-cutanée.
  • Les nanocorps peuvent également être facilement conjugués, par ex avec des agents tueurs de cellules ou des fluorophores.
  • Injectés in vivo, le nanocorps présente une pharmacocinétique très favorable notamment pour l’imaging (élimination rapide par les reins).
  • Dernier point, mais non le moindre, les nanocorps sont beaucoup plus faciles à produire à partir d’une variété d’hôtes (par génie génétique). Ils peuvent aussi être modifiés (humanisés).

Il a été signalé que par ex in vivo, l’élimination des nanocorps par les reins peut masquer le signal d’une cible proche, ou être trop rapide pour permettre une bonne la fixation du nanocorps sur ses cibles. Le marquage fluorescent peut affecter les propriétés de fixation du nanocorps. Des solutions ont néanmoins aussi été proposées pour limiter ces inconvénients.

 

Nanocorps recombinants, des outils avérés et d’avenir prometteur

Les nanocorps peuvent être beaucoup plus que de simples réactifs. Leur obtention par des techniques génétiques et d’expression phagique permet de les cloner, de les sélectionner (phage collections) et de les façonner (constructions), pour optimiser leur affinité, spécificité, solubilité (mutation aa dans le FR2), et aussi de les fonctionnaliser (humanisation, vectorisation, …). Les applications se diversifient, et le futur s’annonce prometteur du diagnostic au thérapeutique. Vous trouverez ci-dessous quelques exemples de leurs utilisations.

Intérêt en recherche : en imagerie, pour l’étude des fonctions des protéines

En 2006 une équipe de chercheurs a, en créant une nouvelle construction appelée « chromobodies » ( nanocorps liés à des protéines fluorescentes), pu suivre en temps réel les cibles intracellulaires endogènes dans les cellules vivantes. Ainsi, grâce à ces constructions, les biologistes peuvent observer de façon dynamique en temps réel les actions de leur protéine d’intérêt.

Les applications, en recherche et à terme en diagnostic, sont bien plus larges : le nanocorps ainsi produits combinés à une protéine fluorescence (gfp) constitue des sondes de petite taille très utile en imagerie moléculaire (notamment SPECT et PET), et en screening.

Les nanocorps ciblant des antigènes intracellulaires (cytosoliques) ont un potentiel particulier en biologie moléculaire de la cellule, et à terme pour identifier de nouvelles cibles diagnostiques ou thérapeutiques : pour étudier l’expression des protéines, ils permettent une imagerie à haute résolution que ne permettent pas les techniques de silencing (down regulation) ou knock-down (Van Audenhove et al., 2014). Ils permettent de mieux corréler la localisation et la fonction des protéines étudiées, jusqu’à l’étude d’interactions protéine-protéines (avec des nanocorps reconnaissant la GFP). Les conditions de pénétration membranaire, et par ex de la barrière hémato-céphalique, restent à investiguer.
L’utilisation de nanocorps a permis l’identification de nouveaux biomarqueurs tumoraux comme par exemple les biomarqueurs de tumeur cérébrale TRIM28 et beta-actin identifiés après analyse en spectrométrie de masse, de complexes nanocorps-antigènes issus d’échantillons de glioblastome multiforme (GMB) (Jovcevska et al., 2014).

Enfin, les nanocorps peuvent améliorer les immuno-tests (Pab, Mab), de par leur haute spécificité, leur stabilité supérieurs, et leur meilleure cinétique. Ils se prêtent aussi aux tests cellulaires ainsi qu’aux immunoPCR.
Leur stabilité a été mise à profit dans des processus requérant des conditions extrêmes de température, de pH ou de force ionique comme le biomarqueur AFP (l’alpha-foetoprotéine) (Chen et al., 2016).

 

Intérêt en immunodiagnostique et thérapeutique

Plusieurs avantages des nanocorps décrits ci dessus en R&D s’appliquent en particulier à l’immunodiagnostique (spécificité, stabilité). Ils peuvent être marqués par des chélates et radioéléments (pour du RIA) ou des fluorophores (pour de la microscopie, de la cytométrie ou du microresau, mais aussi de l’imagerie par scintigraphie, optique, ou par ultrasons). Ainsi, la limite de détection du dosage de l’AFP, biomarqueur de nombreux cancers) passe de 1µg/ml à 0.47ng/ml lorsque des nanocorps anti-AFP sont utilisés (Patris et al., 2014), cette limite peut descendre à 0.0005ng/ ml en immuno-PCR (Chen et al., 2016).

De nombreux projets utilisant des nanocorps sont déjà engagés dans le domaine thérapeutique, comme agent neutralisant d’enzyme ou récepteur, ou comme vecteur d’agent toxique (radioélément, toxine) ou d’agent bioactif (médicament) ciblé sur un organe cible (par ex cancéreux). En octobre 2017, l’entreprise pharmaceutique Ablynx a annoncé des résultats positifs pour son produit de première intention, le caplacizumab, un médicament à base de nanocorps et nanoparticule, issu d’un essai de phase III sur le purpura thrombocytopénique thrombotique acquis (aTTP). Un avantage particulier des nanocorps comparés aux monoclonaux, est de mieux pénétrer les tumeurs, et à terme les cellules (intracorps : voir tableau suivant).

 

Etat de l’art : applications et avancées utilisant les nanocorps

Le tableau ci-dessous est une vue d’ensemble des applications basées sur l’utilisation des nanocorps, leurs avantages et leurs inconvénients lorsqu’ils sont appliqués en tant que produits thérapeutiques, molécules de libération de médicaments, intracorps, outils de diagnostic et/ou d’imagerie, ainsi que les voies de développements actuels.

Nanocorps contre les cibles extracellulaires

Construction :Avantages :
Récepteurs comme cible
EGFR, HER2, c-MET, VEGFR, DR5, CXCR4 / 7
Ligands comme cible
HGF, VEGF, uPA, CXCL11 / 12
Blocs de construction de domaine excellents
Accumulation profonde et homogène dans les tumeurs
Nouveaux épitopes cibles
Limitations :Solutions :
Faible affinité
Elimination rapide dans le sang
Manque d’un fragment Fc Immunogénicité
Constructions multivalentes de nanocorps
Fusion à des nanocorps anti albumine
Addition d’une queue Fc
Humanization
Statut actuel : 
In vitro +++
In vivo:
Xenogreffes ++
Essais cliniques +
Potentiel Thérapeutique

 

Nanocorps pour la libération de médicaments

Construction :Avantages :
Cibles :
VEGFR2, EGFR, c-MET, HER2, MUC1
Libération de toxines
Pseudomonas exotoxin A
Particules de libération
Liposomes, micelles, NANAPs,
polymersomes, polyplexes
Convient pour la conjugaison
Pas de queue Fc
Accumulation tumorale rapide
Peut agir lui-même antagoniste
Limitations :Solutions :
Faible solubilité et / ou stabilité des médicaments
Elimination sanguine rapide affectant principalement la cellule en croissance ou en prolifération
Encapsulation dans des nanoparticules
PEGylation
Viser l’effet de la mort cellulaire
Statut actuel : 
In vitro +++
In vivo :
Xenogreffes ++
Essais cliniques /
Potentiel Thérapeutique

 

Étude fonctionnelle des protéines intracellulaires (intracorps)

Construction :Avantages :
Cibles :
intracellulaires Fascine, cortactine, CapG β caténine, PKCε Vimentine, GFP
Stabilité et activité intracellulaire
Modulation spécifique du domaine/fonction
Facile à fusionner : Aide à la découverte de médicaments
Limitations :Solutions :
Pénétration de la membrane cellulaire requise pour l’usage thérapeutiqueUtilisation d’E.coli enteropathogenic (EPEC)
Nanocorps pénétrant spontanément
Statut actuel : 
In vitro +++
In vivo :
Xenogreffes ++
Applicable pour la recherche en biologie cellulaire

 

Outils de diagnostic (marqueurs du cancer)

Construction :Avantages :
Cibles de biomarqueurs extracellulaires
AFP, CAIX, PMSA
TAG-72, HER2
Grande stabilité
Facile à conjuguer Convient dans plusieurs applications: ELISA, PCR, IHC
Petite taille, propice pour le format puce
Révéler de nouveaux biomarqueurs intracellulaires en IHC
Limitations :Solutions :
Performance accrue souhaitéeSpécifique de l’application
Utiliser un mélange de nanocorps
Statut actuel : 
In vitro +++Applicable pour le diagnostic

 

Imagerie moléculaire

Construction :Avantages :
Cibles
PMSA, MMR, HER2, HGF, VCAM1, CAIX, EGFR
Marqueur
99mTc, 177Lu, 111In, 123I, 68Ga, 89Zr, 124I, 131I
Micro/nanobulles
IRDye800CW, IRDye700DX
Accumulation dans la tumeur rapide et homogène
Elimination sanguine rapide
Conjugaison facile
Imagerie précoce, procédure sûre
Combinaison imagerie et thérapie possible
La chirurgie guidée par l’image devient possible
Limitations :Solutions :
Accumulation dans les reins
Accumulation dans le foie et la rate
Accumulation dans le foie et les intestins
Supprimer l’His-tag
Co-injecter de la gelofusine et / ou de la lysine
Changer d’agent chélateur
Construction spécifique de nanocorps à administrer non marqué
Statut actuel : 
In vitro +++
In vivo :
Xénogreffes +++
Modèles de souris in vivo +++
Essais cliniques + (réussi)
Applicable pour l’imagerie
Potentiel à identifier de nouvelles cibles thérapeutique

D’après I. Van Audenhove, J. Gettemans / EBioMedicine 8 (2016) 40–48

 

Des anticorps de lama comme outils pour la R&D

LamaLes Nanocorps sont utilisés pour leur réaction spécifique sur les antigènes cibles, dans divers immunoassays, imagerie cellulaire et de l’immuno-targetting.

La partie Fc (heavy chain – non spécifique) est utilisée comme un tag (marqueur) que l’on fusionne à une protéine (recombinante) par fusion génétique. Ces LamaFc-Protéines servent d’immunogènes (pour de l’immunisation), et peuvent aussi servir comme antigène marqué dans divers immunoassays (en coating, ou en utilisant des anticorps secondaires -anti Ig de Lama-).

Toujours à l’écoute de la recherche, Interchim® offre désormais des protéines recombinantes liées à des nanocorps de Lama. La plupart de ces protéines sont des cibles thérapeutiques pour la recherche actuelle et future.
Des immunoréactifs issus des hcAbs de Lama sont aussi proposés.

 

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