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La dissolution d’échantillon dans votre laboratoire


Les différentes techniques analytiques permettent aujourd’hui d’obtenir des résultats précis et rapides, mais dépendent en grande partie de la technique de préparation de l’échantillon.
Le but de la préparation d’échantillon consiste à traiter la matrice de l’échantillon et d’en extraire les composés d’intérêts à analyser.

Aujourd’hui, différentes techniques permettent de traiter ces matrices rencontrées dans différentes activités telles que l’environnement, la toxicologie, l’agro-alimentaire, et l’industrie pharmaceutique.

La technique de filtration reste la plus utilisée grâce à l’utilisation de filtres seringues disponibles en différentes porosités. (voir notre gamme UptiDisc™ Interchim®)

En complément,  l’utilisation de colonnes SPE (Solid Phase Extraction – Gamme PolyClean™ & UptiClean™ Interchim®), QuEChERS (gamme QuEChERS Interchim®) et plaques 48 & 96 puits est courante  pour traiter des échantillons dont la matrice est plus complexe.

La dissolution d’échantillon fait partie également de ces techniques de préparation d’échantillon que l’on retrouve principalement dans l’industrie pharmaceutique.

Par définition, la dissolution d’un échantillon est un processus  physico-chimique par lequel un soluté incorporé dans un solvant  forme un mélange homogène appelé solution.

Cette technique est essentielle dans le processus de fabrication et de qualification d’un médicament car elle définira la performance pharmaceutique et la biodisponibilité des principes actifs que l’on retrouvera sous différentes formes telles des comprimés, des gélules mais également des suspensions liquides injectables.

La mise en place d’un test de dissolution nécessite une compréhension de ces mécanismes et reste une technique de développement non standardisée pour l’ensemble des produits car elle peut évoluer au cours du temps de la formulation d’un médicament.

Une réglementation Pharmacopée définit des critères de normalisation mondiale de la mesure des taux de libération des médicaments dans l’organisme.

Globalement, les tests de dissolution vont permettre de :

  • optimiser l’efficacité thérapeutique au cours du développement du produit et l’évaluation de sa stabilité
  • évaluer la qualité et la production d’un produit pour assurer l’uniformité entre les lots
  • évaluer la disponibilité biologique à partir de lots distincts de produits d’un ou de différents fabricants
  • prévoir la disponibilité in vivo (biodisponibilité)

L’automatisation des tests de dissolution sur des systèmes tels que Agilent, Distek, Erweka, Hanson, Pharmatest, Sotax permet d’optimiser ces méthodes.

Comme tout système automatisé, des accessoires et consommables sont nécessaires afin d’assurer un parfait fonctionnement du système.

Interchim® vous propose une gamme complète de dissolution compatible avec l’ensemble des marques d’appareils de dissolution utilisés en laboratoire (Caleva, Distek, Erweka, Hanson, Pharmatest, Sotax, Vankel, Agilent)

 

1. Le panier de dissolution (Basket)

Apparu en 1970, la méthode du panier rotatif était la première méthode officielle. L’appareil est constitué d’un arbre d’entrainement métallique relié au panier cylindrique. Le panier est placé à l’intérieur d’un récipient en verre ou autre matériau inerte et transparent. La température est maintenue constante par un bain d’eau ou une enveloppe chauffante. La solution dans un récipient  est agitée doucement par l’élément rotatif.

Schema panier de dissolution (basket)

Fig 1. QLA Mesh

La méthode USP 1 nécessite un écran de 40 mailles, sauf indication contraire dans la monographie. D’autres maillages peuvent être utilisés pour résoudre des problèmes individuels tels que le colmatage par des particules ou des excipients ainsi que la libération aléatoire du produit.

QLA Mesh

Fig 2. QLA Mesh

Ces paniers sont disponibles sous différentes formes et matériaux.

QLA Baskets

Acier inoxydable 316SS
Fig 3. QLA Baskets

QLA Baskets Plastique

Plastique
Fig 4. QLA Baskets

QLA Baskets en Acier inoxydable 316SS avec revêtement PTFE

Acier inoxydable 316SS avec revêtement PTFE
Fig 5. QLA Baskets

 

2. L’arbre pour panier (Basket Shaft)

Cet accessoire permet de maintenir le panier de dissolution lors de l’agitation dans le bol de dissolution. 

QLA Basket shafts

Arbre pour panier de dissolution
Fig 6. QLA Basket shafts

 

3. La palette d’agitation (Paddles)

La palette d’agitation est un accessoire alternatif aux paniers de dissolution. Le produit est placé directement dans le bol de dissolution. Sa dissolution est réalisée grâce aux mouvements uniformes de rotation de la palette.

Palettes d’agitation

Palettes d’agitation
Fig 7. QLA Paddles

Les revêtements sont disponibles en plusieurs matériaux :

  • Acier inoxyable 316SS (polissage de l’acier afin d’éliminer les impuretés et risques de corrosition)
  • Acier inoxydable 316SS avec revêtement PTFE
  • Fluoropolymère

Palettes_agitation_Interchim_Blog0619

 

4. Le bol de dissolution (Vessels)

Les bols de dissolution sont les pièces essentielles pour d’obtenir des résultats reproductibles et efficaces.

Des nombreux USP définissent les dimensions ainsi que les couleurs des bols de dissolution à utiliser.

Typologie des bols de dissolution

Typologie des bols de dissolution
Fig 9. QLA Vessels

 Couleurs des bols de dissolution

Couleurs des bols de dissolution
Fig 10. QLA Vessels

En accessoires complémentaires, on retrouve des couvercles pour bols (Vessel Cover), cannules d’échantillonnage (Sampling Cannula), canules de filtration (Cannula filters).

Des sels de nettoyage EVER-CLEAN proposés par la société QLA, permettent de nettoyer efficacement les bains d’eau des systèmes de dissolution et de prévenir la formation de micro-organismes. Une dose permet de maintenir la propreté de votre bain durant 8 mois.

 Sels de nettoyage EVER-CLEAR

Sels de nettoyage EVER-CLEAR
Fig 11. QLA EVER-CLEAR

 

En savoir Plus :

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Guide : La chromatographie Couche Mince (CCM)


1. Principe de la chromatographie sur couche mince (CCM)

La CCM est une chromatographie dans laquelle les solutés restent en contact avec la phase mobile et la phase stationnaire durant la même période de temps. Ils parcourent différentes distances en fonction de leurs interactions avec les deux phases. La rétention de chacun des solutés est caractérisée par le rapport frontal Rf.

Principe de la chromatographie sur CCM

 

2. Les spécificités liées aux phénomènes d’évaporation

Spécificités liées aux phénomènes d’évaporation1. Pour un éluant composé de différents solvants, à l’équilibre liquide/vapeur (L/V), la composition de la phase mobile est différente de la phase vapeur car chaque solvant possède une capacité à s’évaporer qui lui est propre.

2. La phase stationnaire s’équilibre avec la phase vapeur par l’adsorption de celle-ci jusqu’à saturation. Si la phase stationnaire est une silice vierge, les vapeurs des solvants polaires sont plus fixées que celle des solvants apolaires. Donc, sa composition est différente de la phase vapeur (V) et de l’éluant (L).

3. Pendant la migration, la phase stationnaire humide se rééquilibre en permanence avec la phase vapeur (V) et les différents composants de la phase mobile peuvent parfois être séparés en conduisant à un front secondaire.

 

3. La migration des analytes

L’échantillon est déposé avec un capillaire sur la ligne de dépôt, préalablement tracée, de la plaque CCM qui est plongée dans la cuve contenant la phase mobile.  Cette dernière s’élève par capillarité dans la phase stationnaire en emportant chaque analyte qui migre à sa propre vitesse en fonction de son affinité envers l’adsorbant et l’éluant.

Migration_des_analytes

 

4. L’interprétation des résultats

Le facteur de rétention (Rf) est défini comme le rapport de la distance parcourue par l’analyte (da) sur la distance parcourue par l’éluant (ds).

Interprétation des résultats

 

Rfa = da / ds
Rfb = db / ds

 

Il en résulte un différentiel de rétention qui donne une idée de la séparation des composés pour des conditions opératoires données :

ΔRf = Rfa – Rfb

 

La zone idéale de séparation se trouve entre les valeurs
0,1<= Rf<=0,4, là où les facteurs de rétention correspondent
à 2<= k <= 10 en chomatographie sur colonne.

 

 

5. Comparaison entre CCM et chromatographie liquide sur colonne

Interprétation des résultats

 

Le transfert vers la chromatographie sur colonne impose de raisonner en volume de phase mobile nécessaire pour éluer les analytes. On en déduit la correspondance suivante où l’acronyme CV (aussi appelé Vs) est un nombre sans dimension :

Vsa = CVa = 1/Rfa = 1 + ka
Vsb = CVb = 1/Rfb = 1 + kb
=> ΔCV = CVb – CVa

CV et le facteur de rétention k en HPLC sont liés par une relation mathématique =>
k =  Ktr x(1/Rf – 1) et avec Ktr = cste = 1
=> Δk = Ktr x[(1/Rfb – 1) – (1/Rfa – 1)]
=>  CV = Δk

 

 

En théorie, dans un mode d’élution isocratique,  il est possible d’être prédictif sur le résultat d’une colonne LC par rapport à une CCM en tenant toutefois compte de variables comme les différences des caractéristiques physico-chimiques  des adsorbants utilisés.

Comparaison entre CCM et chromatographie liquide sur colonne


L’exemple ci-dessus montre une transposition idéale pour les conditions ci-dessous :

Colonne Flash :
L = 115 mm   •   Taille des particules = 50 µm           
Type Interchim : 25G   •   Débit = 21 ml/min

trA = 500 strB = 250 strC = 107 st0 = 75 s
RsA/B = 3,5RsB/C = 4,2RsA/C = 6,9 
kA = 5,7kB = 2,3kC = 0,43 
WA = 93 sWB = 47 sWC = 20 s 

 

6. Et si vous révolutionnez votre chromatographie sur couche mince avec notre application dédiée ?

TLC-to-Flash-and-prep-chromatography-app-whitePensée pour vous aider et vous faire gagner un temps précieux chaque jour, l’application vous permet :

• La détection automatique de vos composés et calcul de vos Rf et vos ΔCV (=ΔK)
• La transmission directe (et sécurisée) de ces informations à votre puriFlash® et son intelligence artificielle « Genius » qui vous proposera la meilleure méthode pour réussir votre purification.
• L’archivage de vos données si vous le souhaitez.

app tlc to flash and prep chromatography

 

En savoir Plus :

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4 Bonnes raisons d’utiliser l’automatisation au laboratoire


4 Good reasons to use lab automation

1. Augmentez votre productivité

Certaines tâches quotidiennes vous éloignent de votre vrai métier.
L’automatisation réalisera ces tâches à votre place et vous libérera du temps pour vous consacrer essentiellement à vos recherches pour augmenter votre productivité.

2. Travaillez en tout sécurité

Certaines synthèses ne peuvent pas être réalisées sans la présence permanente d’un utilisateur pour des raisons de sécurité.
L’automatisation fera ces synthèses, seule, en toute sécurité et en toute confiance

3. Obtenez des résultats plus fiables

Vous avez réalisé une synthèse ayant un résultat très prometteur que vous n’arrivez plus à reproduire ?
L’automatisation enregistrera toutes les données de vos synthèses pour les reproduire et les répéter à tout moment. Elle vous permettra aussi d’améliorer la compréhension de leurs mécanismes, de les faire évoluer pour améliorer vos résultats.

4. Faites des économies

Les avantages de l’automatisation permettront à tous les laboratoires de faire des économies en optimisant le temps de travail pour permettre aux utilisateurs de se focaliser sur l’essentiel de leur activité.

 

Learn more:

  • Consultez l’article montrant les nombreux avantages de l’automatisation
  • Vous souhaitez vérifier que l’automatisation est faite pour
    votre laboratoire ?
    Contactez-nous pour une démonstration et demandez-nous une offre de prix personnalisée
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Laboratoire de synthese ou chimie et si on réduisait notre empreinte carbone ?


1. Comment Interchim® peut aider à réduire l’empreinte carbone dans les laboratoires de chimie ?

L’empreinte carbone a beaucoup augmenté ces dernières années et contribue à un changement climatique qui, s’il n’est pas maîtrisé rapidement, aura un impact néfaste sur notre avenir.

Nous devons, par conséquent, tous agir, à nos niveaux, avec nos moyens pour faire diminuer cette emprunte carbone néfaste en changeant nos façons de faire, dès que cela est possible, par des actions en total respect avec notre environnement.
Interchim®, considérant ce phénomène comme l’une de ses priorités depuis longtemps, a cherché les meilleures solutions pour aider les laboratoires de chimie à diminuer leur empreinte carbone.

Ces solutions permettent aujourd’hui de vous proposer des équipements innovants et efficaces pour la chimie qui :

  • Réduisent nos besoins en énergie.
  • Suppriment certains rejets de déchets toxiques.
  • Recyclent certains produits chimiques.
  • Ne relarguent plus de gaz dangereux dans l’atmosphère.

Dans le but de faire de vos laboratoires des endroits plus respectueux pour vous-même et notre Planète.

 

2. Comment Interchim® pour vous aider à réduire votre empreinte carbone dans votre laboratoire de synthèse ?

Interchim® propose plusieurs solutions :

a. Les Findensers

Findenser

Les Findensers sont des réfrigérants à air qui couvrent plus de 95% des applications réalisées avec des réfrigérants à eau.

Comparatif de la consommation d'au avec un condenseur à eau et le findenser

Les Findensers réduisent votre empreinte carbone, car en plus de préserver l’eau, élément indispensable pour nos vies, ils vous permettront de ne plus avoir besoin de toute l’énergie nécessaire que pour son traitement, son approvisionnement et son utilisation.

b. Les blocs chauffants Heat-On

Blocs chauffants Heat-OnLes Heat-On sont des blocs en aluminium qui s’emboîtent sur le plateau d’un agitateur magnétique et qui permettent de chauffer les milieux réactionnels contenus dans des ballons sans l’utilisation d’eau ou d’un liquide caloporteur. Ils chauffent très rapidement.

Les Heat-On réduisent votre empreinte carbone car en plus de préserver l’eau, ils consomment très peu d’énergie et n’engendre aucun déchet toxique comme le font les bains d’huile.

Une université australienne a choisi d’utiliser les Heat-On Block pour remplacer tous ses bains d’huile et à ainsi réduit la quantité de déchets d’huile nocifs qu’elle produisait.

c. Le système StarFish

StarFishLe StarFish est un poste de travail compact et polyvalent. Il peut être utilisé pour chauffer, agiter jusqu’à cinq ballons à la fois. Il permet également d’augmenter la productivité et d’économiser de la place dans le laboratoire.

Le StarFish réduit votre empreinte carbone car, en plus de préserver l’eau, il utilise beaucoup moins d’énergie par rapport à cinq montages installés les uns à côté des autres et utilisant chacun, un agitateur magnétique chauffant par montage.

Tout comme les Heat-On, il peut être utilisé à la place d’un bain d’huile et engendrer aucun déchet toxique.

L’université de Bradford a choisi d’utiliser le StarFish à la place de plusieurs montages utilisant, chacun des bain-maries ou des chauffes ballons électriques très consommateurs d’énergie

d. L’évaporateur GreenHouse Blowdown Evaporator

Evaporateur GreenHouse Blowdown EvaporatorLe GreenHouse Blowdown Evaporator est un système permettant de réaliser de 8 à 24 évaporations en parallèle sans le moindre relargage de solvant dans l’atmosphère. Très compact, il utilise aussi peu de place.

Le GreenHouse Blowdown Evaporator réduit votre empreinte carbone car, il utilise peu d’énergie pour faire plusieurs évaporations en même temps. Il permet aussi de récupérer le solvant évaporé et de le réutiliser.

 

e. Les refroidisseurs Huber

Refroidisseurs HuberLes refroidisseurs Huber sont des systèmes permettant d’utiliser un liquide refroidissant en circuit fermé pour alimenter vos réfrigérants à eau et ceux de vos évaporateurs rotatifs.

Les refroidisseurs Huber sont équipés d’un système de réfrigération sans CFC. Ils assurent un refroidissement très stable en étant extrêmement silencieux.

Les refroidisseurs Huber réduisent votre empreinte carbone car en plus de préserver l’eau qui ne part plus aux égouts, l’énergie nécessaire pour son traitement, son approvisionnement et son utilisation, ils  sont éco énergétiques et ils n’engendrent aucun déchet toxique.

 

Pour faire de vos laboratoires des endroits plus respectueux pour vous-même et notre Planète Interchim® est là pour vous apporter des solutions pour réduire l’impact carbone qui doit absolument baisser.

Ne pensons plus que nos actions même les plus simples ne feront aucune différence. Agissons sans plus attendre. Notre Terre a besoin de l’aide de chacun.

Nous cherchons continuellement des solutions écologiques et ne manqueront pas de vous les partager.

Pour plus d’information contactez-nous au 04 70 03 88 55 ou par email :  interfine@interchim.fr

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Purification des protéines : Guide et éléments clés pour les réussir.


Pouvons-nous généraliser une stratégie de purification de protéines ?

Bien entendu, la purification dépend de la protéine et du contexte. Il y a donc des aspects généraux à étudier avant de mettre en place toute purification protéique.

Brièvement :

  • Le but est de trouver le chemin le plus court entre le matériel de départ et le produit final tout en ayant le meilleur rendement et garder la plus grande activité biologique
  • La pureté à obtenir est définie par l’utilisation finale du produit.

1. La pureté des protéines nécessaire est fonction des applications

La pureté des protéines est fonction des applications

Même les plus petites impuretés peuvent provoquer de grands problèmes surtout dans les applications thérapeutiques. Ces impuretés, dans les cas plus graves, peuvent être biologiquement actives. Mais, pour préserver le rendement, quand la pureté nécessaire est atteinte, c’est suffisant : il est important de différencier les impuretés devant être éliminées totalement de celles qui doivent être réduite à un niveau acceptable.

Puisque différents matériels de départ contiennent différentes impuretés, les purifications seront différentes.

La ligne fondamentale est : la qualité du produit final ne doit jamais être compromise.

 

2. Les quantités de protéines peuvent être très différentes

Les quantités de protéines peuvent être très différentes

L’échelle de la purification dépend de la quantité de protéine nécessaire mais également du volume d’échantillon et de la proportion de contaminants devant être éliminés.

La quantité de protéines purifiées peut être obtenue par de multiples cycles de purification à petite échelle si le scale-up n’est pas une option.

 

3. La finalité est l’activité biologique du produit final

3 règles :

  • Eliminer les protéases
  • Trouver les conditions qui stabilisent la protéine cible
  • Travailler rapidement

Il n’est pas toujours suffisant d’obtenir un haut degré de pureté des protéines, l’homogénéité est également très souvent importante.

Les altérations des protéines, telles que glycosylations, alkylations ou phosphorylations peuvent modifier le produit final en termes d’activité biologique et/ou de structure. Vous pouvez être amené à pratiquer d’autres purifications afin de séparer des protéines très similaires mais n’ayant pas des propriétés identiques.

Les principes basiques de purification des protéines :

De grosses colonnes ou de grandes quantités de résines de purification peuvent s’averer très onéreuses. Ainsi, il peut être intéressant de réduire les volumes à purifier dans une étape préalable à la purification proprement dite. Un des meilleurs moyens pour réaliser cela est d’utiliser une technique d’adsorption dans laquelle la protéine d’intérêt est liée à la résine et peut être éluée dans des volumes plus faibles (Echange d’ions, HIC, Affinité).

Les protéases ont une action très rapide, vous devrez donc l’être davantage. En effet, les protéases sont très souvent présentes dans les échantillons crus et doivent être éliminées très rapidement. Introduisez une étape réduisant la quantité de protéases au préalable de la purification. Vous pouvez également travailler à +4°C ou ajouter des inhibiteurs de protéases (N’oubliez pas que tout ce que vous ajoutez devra être éliminé ensuite).

Dans les premières étapes travaillez avec des techniques efficaces pour capturer la protéine d’intérêt et réduire le contenu en contaminant. Continuez avec des étapes plus sélectives pour des séparations optimales (polishing) : les granulométries des résines successives doivent être de plus en plus petites.

Combinez des étapes avec différent principes de séparation et des résines avec des sélectivités différentes pour attaquer le problème de purifications sous différents aspects.

Evitez les étapes de conditionnement en choisissant des séquences optimales : exemple HIC après IEX.

Réduisez la manutention des échantillons lors des étapes pour éviter des procédures longues qui risquent une perte d’activité ou de rendement.

 

4. Résumé des règles de base :

– Travaillez vite :

  • Eliminez les protéases pour garder active votre protéine
  • Réduisez les manutentions en choisissant une excellente combinaison de techniques

– Préparez vos échantillons pour prolonger la durée de vie de vos résines :

  • Centrifugez et filtrez vos échantillons avant leur injection dans la colonne.

– Les méthodes chromatographiques :

En savoir Plus :

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Silices sphériques et silices irrégulières : quelles différences ?


Structure des silices

Les silices, utilisées en chromatographie liquide, se partagent en deux grandes catégories :

  • Les silices dont les particules sont irrégulières
  • Les silices dont les particules sont sphériques

Si les premières sont encore largement utilisées dans le domaine de la purification par chromatographie Flash ou à l’échelle industrielle, les secondes sont aujourd’hui le standard absolu pour l’analyse par (U)HPLC.

Mais quels sont leurs avantages ou leurs inconvénients ?
Pourrait-on indifféremment les intervertir dans leur usage respectif ?

Pour répondre, examinons d’abord la structure de la silice.
Chimiquement elle se compose d’atomes de silicium et d’oxygène. Chaque atome de silicium est tétravalent et lié à des atomes d’oxygène. La structure générale peut se représenter ainsi :

Composition chimique de la silice

 

Formes des silices

Qu’elles soient de forme irrégulière ou sphérique, les silices les plus courantes conservent cette structure chimique. Lors de leur synthèse, les procédés mis en œuvre conduisent à la réalisation de particules aux formes qui nous intéressent.
Les silices sphériques ressemblent à de petites billes poreuses alors que les particules irrégulières sont assimilables à de petits cailloux eux aussi poreux.

Formes des silices

 

Caractéristiques physico-chimiques

Ces silices se caractérisent par des valeurs chimiques et physiques qui leur confèrent des propriétés spéciales indispensables pour séparer des composés chimiques aux structures très variées.

Physiques

• Géométrie (irrégulière, sphérique)
• Granulométrie ou taille des particules (dp en µm)
• Diamètre des pores (Angström)
• Volume poreux (mL/g)
• Surface spécifique (m2/g)
  

Chimiques

• Nature et type du greffage
• % Couverture (% carbone, taux de couverture µmol/m2)
• Type de silice (pure ou non)

 

Empilement des silices dans une colonne

Une colonne Flash, (U)HPLC ou préparative remplie avec ces silices sera plus ou moins efficace selon la granulométrie des particules. On estime au mieux qu’un plateau (étage de séparation) ne peut être inférieur au diamètre de la particule de silice. En conséquence, plus la particule est petite, plus on a de « plateaux » dans la colonne. Dans l’exemple ci-dessous, quel que soit le modèle théorique, on déduit que des particules de 15 µm présenteront un empilement 2 fois plus compact que des particules de 30 µm.

Les silices irrégulières présentent, comme leur nom l’indique, des formes indéfinies pour lesquelles il est difficile de mesurer le diamètre moyen. De plus, leur empilement est désordonné et abouti à une compacité beaucoup plus faible que les silices sphériques. Enfin, ces silices contiennent en général de nombreuses « fines », c’est-à-dire de petites fractions qui peuvent passer à travers les frittés des colonnes.

L’arrangement des silices sphériques est bien supérieur aux silices irrégulières. L’écoulement des solvants à travers la colonne suit un chemin plus linéaire. Les familles d’analytes sont moins dispersées et sortent de la colonne dans un volume de solvant plus faible. On observe des pics plus fins et plus gaussiens.

Empilement de la silice

Conclusion

On comprend donc aisément l’intérêt des silices sphériques pour qui cherche une séparation plus efficace. Les silices de plus petites granulométries offrent la possibilité de réduire les longueurs des colonnes et donc le temps d’élution tout en conservant une bonne séparation.

Pour l’analyse et la quantification modernes, l’usage des silices sphériques est une évidence. Pour la purification, il faut trouver le meilleur compromis entre le prix de l’adsorbant et le rendement de séparation.

En savoir Plus :

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SCAT Europe : Les 4 produits indispensables dont vous devriez disposer pour travailler en laboratoire en toute sécurité


Interchim accompagne ses clients dans toutes les problématiques qu’ils rencontrent dont la maximisation de la sécurité au sein des laboratoires.

 

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SCAT Europe assure votre sécurité face aux produits que vous manipulez

SCAT qui signifie « Safety-Center-Analysen-Technik », est une société allemande qui a pour activité principale la protection des utilisateurs de laboratoires d’analyses face aux substances nuisibles à leur santé.
SCAT Europe, c’est plus de 600 produits vous permettant à la fois de faire des économies non négligeables et de garantir votre sécurité dans votre environnement de travail via son panel de solutions qui ne cesse de s’accroître afin de répondre au mieux aux exigences et contraintes de ses clients.

 

SCAT Europe : notre sélection de 4 produits indispensables pour votre sécurité

 

1/ Les SafetyCaps

Safetycaps_SCATEurope_Interchim_Blog_0416Travaillez dans des conditions optimales en HPLC, Préparative et Flash chromatographie avec le SafetyCaps de SCAT!
Ce bouchon unique qui, grâce à sa composition en PTFE pur et polyéthylène, assure une compatibilité avec tous les solvants.  Ses raccords pour maintenir les tubulures dans le flacon et sa soupape de ventilation, empechera toute diffusion des solvants dans votre laboratoire. Le filtre intégré de la soupape de ventilation protège votre phase mobile de toute contamination par les particules de poussières en suspension dans l’air vous garantissant un fonctionnement optimale des pompes d’aspiration. Sans perte de solvants, les proportions du mélange de phase mobile restent constantes, ce qui a pour conséquence une meilleure reproductibilité lors de vos analyses.

 

2/  Les Safety Waste Caps

SCAT Europe propose également le Safety Waste Caps. Filtre Scat
Un filtre conçu pour absorber 99% des substances volatiles qui peuvent se propager après analyse lors de la collecte des solvants.
En effet, les substances toxiques, qui s’échappent lors du déversement des déchets liquides, sont retenues par le filtre d’air sortant. Celui-ci, à base de charbon actif, se compose  de PTFE pur et PE-HD qui le rendent résistant contre les solvants organiques et acides et solutions basiques.
Ce système de sécurité est adaptable à de très nombreux bidons, grâce à la diversité de la gamme de filetages ainsi que l’ajout d’accessoires qui le rendent extrêmement polyvalent.

 

3/ Les Entonnoirs de sécurité pour déposer vos liquides en toute sécurité

Entonnoir Sécurité SCATAfin d’ éviter tous risques d’accidents tel que des brûlures ou pollution, SCAT Europe met à votre disposition un système d’entonnoir
vous permettant de vider vos erlens, vos ballons et vos différents déchets en toute sécurité.
Sa fabrication en PE-HD (Polyéthylène haute densité) lui assure une excellente compatibilité et résistance chimique.
Afin de s’adapter à vos exigences, différents modèles d’entonnoirs sont disponibles (ajout d’une bille, d’un couvercle, d’une vanne…)

 

4/ Les dispositifs de contrôle du niveau de remplissage

SCAT Europe propose un dispositif de contrôle de niveau de remplissage du bidon de collecte pouvant être Controle_Niveau_De_Remplissage_SCATEurope_Interchim_Blog_0416couplé avec une pompe HPLC,  Prep ou une Flash . Celles-ci  seront stoppées en cas de manque de phase mobile ou bien si le bidon de collecte est plein.
Ce dispositif permet de garder un oeil sur les niveaux de remplissage, même à distance.
En effet, il vous informe lorsque les niveaux de remplissage sont critiques, par le biais d’une alerte acoustique (signal sonore) et d’une alerte optique (lampe DEL). Grâce à l’adoption de ce dispositif dans votre laboratoire vous éviterez tous risques de débordement ou de désamorçage des pompes.

Parce que vous proposer un service de qualité est notre priorité, SCAT Europe est la clef pour assurer votre sécurité au sein du laboratoire et améliorer votre confort de travail.

En savoir plus :

 

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Chimie en continu : pourquoi le système PhotoSyn™ est idéal pour vos réactions chimiques ?


Logo Uniqsis

Le PhotoSyn™ est un module pour réaliser des réactions photochimiques en chimie continu et une montée en échelle.

PhotoSyn LED Photoreactor

PhotoSyn™ LED Photoreactor

Le PhotoSyn™ est équipé de 720 lampes puissantes, à intensité ajustable, il permet de travailler sur plusieurs sources lumineuses :

  • 365nm (UV) + 455nm (bleu)
  • (455nm) ; lumière bleue pour application photo redox
  • 455nm (bleu) + 555nm (vert) + blanc
  • Faisceau lumineux LED à façon

Combiné au Cold Coil™ ou au Polar Bear Plus Flow™, le PhotoSyn™ devient un système autonome de chimie en continu piloté par une l’interface facile d’utilisation sur laquelle est sélectionnée l’intensité et les différentes couleurs. Incluant un port RS232, elle peut aussi être contrôlée à distance.

Polar Bear Plus FlowFlowSyn ColdCoilInterface de pilotage
Polar Bear Plus Flow™FlowSyn ColdCoil™Interface de pilotage

 


Les boucles de synthèse et le micro réacteur peuvent être utilisés comme réacteur de synthèse.

Coil reactorMixer reactor block
Coil reactorMixer reactor block

 


La boucle de synthèse peut-être en PFA ou PFA chromé pour optimiser la réflection et couvre une gamme de volume de 2 mL à 52 mL. Le faisceau lumineux à LED est incurvé pour bien concentrer la lumière sur la boucle de synthèse et optimiser son irradiation.

Le micro réacteur en verre peut aussi être utilisé pour optimiser les mélanges des réactifs ou en tant que réacteur de synthèse. Dans ce cas, un mandrin très réfléchissant est utilisé pour assurer une pénétration maximale de la lumière à l’intérieur de ce réacteur.

La chaleur, dégagée par le faisceau lumineux, est dissipée grâce à une circulation d’eau ou de gaz comprimé dans la double enveloppe inclue dans la paroi du PhotoSyn™.

Un refroidissement par convection est également incorporé pour que la température de la boucle de synthèse soit contrôlée indépendamment par le Cold Coil™ ou par le Polar Bear Plus Flow™.

Le PhotoSyn™ a été conçu pour qu’il n’y ait aucune fuite de lumière et par conséquent, pas besoin d’un écran teinté ou étanche à la lumière.

Des verrouillages de sécurité sont également installés pour empêcher l’exposition accidentelle à une lumière si l’on tente d’enlever le module PhotoSyn™ durant une synthèse.

N’hésitez pas à nous contacter.

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Bénéficiez de notre service de fabrication à façon (colonnes & plaques) pour optimiser vos préparations d’échantillons SPE


A. Fabrication à façon sur demande

Nous vous proposons de fabriquer des colonnes et plaques multi-puits suivant vos spécifications.
Pour cela il suffit de nous faire parvenir une demande à :
interchrom@interchim.com
Fax : 04 70 03 82 60 – Tél. : 04 70 03 73 09

en précisant les points suivants :

  • le type d’adsorbant désiré
  • la masse d’adsorbant
  • la nature de la colonne, de la plaque ou du contenant
  • le volume de la colonne, des puits de la plaque ou du contenant
  • la nature et la porosité des frittés
  • la quantité des colonnes désirées

L’un de nos spécialistes vous contactera sous 48 heures pour valider la faisabilité du projet. Un contrat de confidentialité des données pourra être signé entre les deux parties.


Type d’adsorbant

Il peut être :

  • un adsorbant fabriqué par vos soins. Dans ce cas, il vous faut nous préciser sa nature et ses caractéristiques physiques ainsi que sa fiche de sécurité.
  • un adsorbant commercialisé et/ou fabriqué par une autre société
  • un adsorbant Interchim®

Masse d’adsorbant

Elle peut être comprise entre 15 mg et 70 g (fonction du volume de la colonne ou de la plaque choisie). La précision de nos pesées peut aller jusqu’à 1% près avec la possibilité d’obtenir un certificat de pesée pour les plaques 96 et 48 puits.

Nature de la colonne, de la plaque ou du contenant

Trois types de colonnes proposés :

  • Réservoir droit en polypropylène
  • Réservoir large capacité (LRC) en polypropylène
  • Réservoir droit en verre

3 Colonnes SPE sérigraphiées Plaques SPE Interchim

Deux types de plaques proposés :

  • Plaques 96 puits
  • Plaques 48 puits

Nous pouvons remplir tout autre type de contenant s’il est compatible avec nos systèmes de remplissage.

Volume de la colonne, de la plaque ou du contenant

  • 1 – 3 – 6 – 15 – 25 – 75 – 150 mL pour les tubes droits en polypropylène
  • 15 mL pour les réservoirs LRC en polypropylène
  • 6 mL pour les tubes droits en verre
  • 2 mL pour les plaques 96 puits en polypropylène
  • 5 ou 7 mL pour les plaques 48 puits en polypropylène

Nature et porosité des frittés

  • Polyéthylène pour les tubes droits en polypropylène et les réservoirs LRC
  • PTFE pour les tubes droits en verre
  • Polyéthylène pour les plaques 48 & 96 puits

B. Les contenants

ContenantsPhotoNatureVolumes disponiblesFrittés disponibles
Colonnes standardsSPE - Tube standardPolypropylène grade médical(1 – 3 – 6 – 15 – 25 – 75 – 150) mL20 µm Polyéthylène
Colonnes LRCSPE - Tube LRCPolypropylène grade médicalRobotic Large Capacité (LRC) 15 mL20 µm Polyéthylène
Colonnes GlassSPE - Tube verreVerre6 mL20 µm PTFE
CartouchesSPE - CartouchePolypropylène grade médicalType 300 – 600 – 900 mg20 µm Polyéthylène
Plaques 96 puitsSPE - Plaques 96 puitsPolypropylène grade médical2 mL avec des puits carrés20 µm Polyéthylène
Plaques 48 puitsSPE - Plaques 48 puitsPolypropylène grade médical5 mL avec des puits carrés20 µm Polyéthylène

 

C. La technologie Interchim® : Accurate Bed Technology™

Le procédé de fabrication Interchim® Accurate Bed TechnologyTM a été développé pour garantir une reproductibilité unique de lot à lot et de colonne à colonne.
Nos adsorbants SPE possèdent une distribution granulométrique optimisée et contrôlée de manière drastique.
Les quantités d’adsorbants sont introduites par pesée avec une précision de +/-1%.
Un certificat de pesée est délivré avec chacune de nos plaques 96 puits attestant de la masse réelle introduite dans chaque puits.
Il en résulte l’optimisation de la technique d’analyse et de l’interprétation des résultats.
Nos colonnes et plaques d’extraction SPE sont livrées dans un emballage PEHD/Al dédié au stockage longue durée.
Notre grande flexibilité et notre expérience dans le domaine du service nous permettent de satisfaire toute demande de fabrication à façon sans surcoût majeur.
Cette démarche permet d’apporter des solutions techniques nouvelles aux problématiques de nos clients et ainsi de leur faciliter le développement et l’optimisation de leur préparation d’échantillon.

Colonne SPE avec légendes

 

En savoir plus :

  • Retrouver nos consommable SPE et notre instrument, le SPE 6.25ws WorkStation sur notre site www.interchim.com
  • Consultez notre article (bientôt disponible) dédié à la méthodologie à suivre pour réussir vos préparations d’échantillons
  • Consultez notre article (bientôt disponible) dédié au développement et à l’optimisation d’une méthode SPE.
  • N’hésitez pas à nous contacter.
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Développement de méthode de purification des peptides en phase inverse


 

Introduction

La chromatographie en phase inverse est une technique très utilisée pour purifier les peptides. Cette technique doit sa popularité au fait que les temps de purification sont assez courts ainsi qu’aux efficacités atteintes. Les phases mobiles utilisées (principalement acétonitrile et eau) sont volatiles, ce qui facilite les étapes de concentration/lyophilisation.

Préparation de l’échantillon – Solubilité des peptides

La solubilité des peptides en solution dépend de plusieurs paramètres :

  • la séquence en acides aminés (si des résidus hydrophobes sont présents, cela diminue la solubilité en milieu aqueux)
  • la taille et la structure tertiaire des peptides. La solubilisation change, en fonction de la répartition des résidus
  • pourcentage en résidus chargés (il faudra appliquer des pH particuliers pour aider la solubilisation).

Il existe quelques règles à connaître pour la solubilisation en milieu aqueux :

  • Les peptides constitués de moins de 5 résidus sont généralement solubles, sauf si les résidus sont hydrophobes (Tryptophane, Isoleucine, Leucine, Phénylalanine, Méthionine, Valine ou Alanine).
  • Les peptides hydrophiles contenant plus de 25% de résidus chargés (Acide glutamique, Acide asparagique, Lysine, Arginine et Histidine) et moins de 25% de résidus hydrophobes sont généralement dissous dans un milieu aqueux, à condition que les résidus chargés soient distribués dans toute la séquence
  • Les peptides hydrophobes contenant de 50% à 75% de résidus hydrophobes peuvent êtres insolubles ou partiellement solubles dans des solutions aqueuses, même s’ils contiennent 25% de résidus chargés (généralement, ils sont solubles dans le TFA et l’acide formique)
  • Les peptides acides (residus Acide glutamique et Acide asparagique) et basiques (residus Arginine, Lysine, Histidine) sont plus solubles à pH neutre qu’à pH acide.
  • Les peptides très hydrophobes qui ont plus de 75% de résidus hydrophobes ne se dissolvent pas dans des solutions aqueuses. Il est préférable de faire un dépôt solide pour convenablement injecter ces peptides.
  • Les séquences peptidiques comportant une très grande proportion en Sérine, Thréonine, Acide glutamique, Acide asparagique, Lysine, Arginine, Histidine, Asparagine, Glutamine ou Tyrosine peuvent former un réseau de liaisons hydrogènes intermoléculaires et ont une tendance à former des gels en solution aqueuse quand ils sont concentrés. Ces peptides peuvent être traités comme des peptides hydrophobes.

Bien entendu, avant de passer l’échantillon sur la colonne, il est préférable de tester la solubilité d’une petite partie dans les conditions de début de méthode. Dans le choix des solvants, préférez un solvant facilement retirable par lyophilisation pour récupérer les solutés le plus pur possible.

 

Comment sont élués les peptides ?

Les interactions qui régissent les purifications de peptides en phase inverse sont entre la phase stationnaire et le squelette hydrophobe du peptide. Elles sont non dispersives et peu sélectives avec 2 mécanismes principaux qui sont de l’adsorption et du partage.

Les petits peptides (avec des masses molaires inférieures à 3kDa) sont élués par un mécanisme de partage tandis que les peptides plus gros sont élués principalement par un mécanisme d’adsorption. Cela revient à dire que les molécules à l’injection se « collent » contre la phase stationnaire, puis éluent dès que la proportion en solvant organique atteint un pourcentage défini.

Rétention en fonction de la fraction volumique d’acétonitrile

Rétention en fonction de la fraction volumique d’acétonitrile

 

Choix de la phase stationnaire

Choix de la phase stationnaire

Le choix de phase stationnaire dépend de la longueur des chaines peptidiques des solutés qui peut limiter les interactions par gêne stérique.

On utilisera de préférence une colonne C18 pour des peptides de tailles petites et moyennes, puis une colonne C8 pour des peptides plus importants et C4 pour des polypeptides.

Le second paramètre à prendre en compte est la porosité de la phase à employer. En effet, plus le peptide sera long, plus il sera difficile de le faire passer dans un pore de petite taille. Les peptides de 1 à 5kDa se sépareront avec une taille de pore de 100Å, ceux entre 5 et 20 kDa pourront être séparés avec une taille de pore de 200Å, et les polypeptides seront utilisés avec une taille de pore de 300Å.

Le dernier point concerne la taille des particules. Etant donnée la difficulté de certaines purifications, il n’est pas intéressant d’utiliser des tailles supérieures à 30µm.

 

Choix des conditions de solvants

Les solvants les plus utilisés sont l’eau et l’acétonitrile. L’acétonitrile permet d’augmenter l’élution des peptides. Le fait que ce solvant ne réponde pas trop en UV et soit facilement retirable, en fait un choix tout indiqué.

Il est courant d’utiliser en même temps de l’acide trifluoroacétique (TFA) comme agent d’appariement d’ion (cela permet de réduire les interactions ioniques entre les peptides et la phase stationnaire). La  forte volatilité du TFA en fait un bon élément car facilement retirable (attention toutefois à ce qu’il soit présent en même proportion dans les deux solvants). Son inconvénient est qu’il rendra difficile la détection MS. Il faut alors, soit baisser sa concentration (mais on dégrade le profil), soit utiliser un autre agent comme de l’acide formique par exemple qui permet la détection.

Pour des applications avec des composés très hydrophobes, il est possible d’utiliser de l’isopropanol, solvant avec un pouvoir éluant plus important. Il présente l’avantage, non négligeable, de garder l’activé biologique des peptides. Ce solvant est principalement utilisé pour des polypeptides sur colonne C4, 300Å.

Généralement on commence la méthode avec 5% de solvant fort pour augmenter la force éluante de 1%/min, ce qui permet d’obtenir de bonnes résolutions.
Pour des applications avec des peptides polaires, il faut utiliser un mode HILIC, en démarrant avec 95% d’acétonitrile pour tendre vers 85%.

 

Influence des paramètres

Plusieurs paramètres peuvent permettre d’optimiser les purifications :

  • Gradient : Comme expliqué dans la partie mécanisme, les peptides (>3kDa) sont élués par un mécanisme d’adsorption. Un gradient par palier pour l’élution peut s’avérer utile.
  • Réactif d’appariement d’ion. Le TFA est le plus utilisé mais il est possible d’utiliser du FA, PFPA, HFBA (agent anionique) ainsi que du TEA, TBA (agent cationique) qui pourront alors aider à la séparation de peptides possédant des résidus Basiques.
  • Température : la température de la colonne est un critère d’optimisation. Il permet de diminuer la viscosité du solvant (permettant une baisse significative de la contre-pression) tout en permettant de diminuer le temps de sortie des produits. Attention toutefois à ne pas dégrader les solutés avec une température trop élevée.
  • Débit : Si pour les petites molécules, le débit est un critère d’optimisation permettant de gagner du temps avec une petite perte de résolution, c’est le contraire pour les peptides plus importants : une augmentation du débit entrainera une dégradation du profil de la purification.

Courbe de Van Deemter

Pour les peptides de faible masse molaire, il existe un débit optimal
(courbe de Van Deemter….)

Pour les peptides de masse molaire élevée, l’augmentation du débit altère le profil des pics. Cela peut même provoquer des dédoublements de pic si le débit est trop élevé.
Tyrosine : 181 g/mol
Myoglobin : 17 000 g/mol
Albumin : >60 000 g/mol

 

Troubleshooting

Si pas de rétentionRétention trop grande ou pas d’élutionSélectivité insuffisante
Vérifier le solvant de l’échantillon (la force éluante doit être inférieure ou égale à la force éluante de la phase mobile de début de run)

Vérifier la concentration en réactif d’appariement d’ions (généralement le réactif est volatil)

Vérifier le conditionnement de la colonne (éviter de laisser la colonne sous plus de 95% de solvant organique)

Diminuer la concentration de solvant organique

Diminuer la pente du gradient
Vérifier la nature et la concentration en réactif d’appariement

Augmenter la concentration en solvant organique

Augmenter la température

Changer de colonne (tester une colonne C8 ou C4 si C18 ne fonctionne pas)
Modifier le réactif d’appariement d’ion
Modifier la pente du gradient

Modifier le solvant organique (par exemple mélange acétonitrile/IPA, 90/10 max, en remplacement de l’acétonitrile seul pour les peptides très hydrophobes)

Changer de colonne (C18, phényle, C8, C4)

 

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