Interchim – Blog_fr | Actualités et informations sur le monde scientifique
Vous êtes ici : Accueil  Interchim - Blog_fr






Analyse directe de protéines avec Advion Touch Express Open port sampling interface (OPSI)


1. Principe de fonctionnement du Touch Express d’Advion

Le Touch express est un nouveau système d’introduction d’échantillon pour l’analyse en spectrométrie de masse utilisant une technique développée par Gary Van Berkel et Vilmos Kertesz du laboratoire national d’Oak Ridge: Open Port Sample Interface (OPSI).

Ce système d’introduction d’échantillon couplé à un spectromètre de masse expression CMS Advion fournit rapidement (en moins de 30 secondes) un résultat à partir d’une surface, d’un solide ou d’un liquide.

Le système OPSI est constitué d’un port ouvert balayé en continu par un solvant envoyé ensuite directement dans la source electrospray (ESI) du spectromètre de masse.

L’analyse est effectuée par simple contact d’un échantillon sur ce port ouvert.

OPSI PALLab

Figure 1 : Touch Express couplé au spectromètre de masse expressionL CMS.
L’analyse est réalisée avec une source ESI en mode positif en utilisant de l’acétonitrile
avec 0,1% d’acide formique comme solvant de make-up à un débit de250µL/min.

 

Menisque du solvant sur port ouvert

Schéma OPSI

1. Solvant make-up pompe (250µL/min)
2. Envoi de l’échantillon vers la source ESI par Effet Venturi

Figure 2 : Fonctionnement de l’OPSI.
Le solvant de make-up est envoyé sur le port ouvert où il forme un ménisque
avant d’être envoyé vers la source d’ionisation sous l’effet Venturi
du gaz de nébulisation.

 

2. Exemple d’application avec leTouch Express OPSI couplé à un spectromètre de masse expressionL CM

Dans l’exemple ci-dessous, le Touch Express OPSI est couplé à un spectromètre de masse expressionL CMS pour démontrer la rapidité d’analyse de protéines : 2µL de myoglobin (cheval) ainsi que 2µL de cytochrome C (cheval) à une concentration de 1mg/mL dans 10mM d’acétate d’ammonium sont déposés directement sur le port avec une pointe de pipette.

Spectre Myoglobin

Figure 3 : analyse de la myoglobine avec le Touch Express OPSI
3a. Spectre de masse de la myoglobine
3b. masse déconvoluée et non chargée de la myoglobin

 

Spectre_Cytochrome

Figure 4 : analyse du cytochrome C avec le Touch Express OPSI
4a. Spectre de masse du cytochrome C
4b. masse déconvoluée et non chargée du cytochrome C

 

Résultats :

Après l’analyse de l’échantillon, une déconvolution de charge est effectuée grâce au logiciel Advion Data Express qui calcule automatiquement la masse de la protéine non chargée à partir du spectre de la biomolécule obtenue. Les spectres de masse et la masse déconvoluée et non chargée de la myoglobine et du cytochrome C sont présentés fig 3 et 4.

Un total de 14 ions de la myoglobin est détecté (fig 3a). La masse non chargée de la myoglobine est de 16 951.2 (fig 3b).
De même pour le cytochrome C un total de 12 ions est détecté. La masse non chargée du cytochrome C est de 12 359.3 (fig 4b).

 

Conclusions :

Le Touch Express OPSI fournit :

  • Une analyse directe par contact de l’échantillon (surface, solide ou liquide)
  • Une analyse rapide < 30s

Le tout sans aucun risque de contamination puisque le port est continuellement rincé par le solvant de make-up.

 

En savoir plus :

Laisser un commentaire    




SPE, HPLC et Flash Prep LC : les différences entre ces 3 processus séparatifs


1. Les différences entre SPE, HPLC et Flash Prep LC

SPE (pour Sample prep Extraction)

  • Processus séparatif discontinu
  • Analytes de polarités et structures différentes
  • Echantillons de mélanges complexes dans lesquels se trouvent un grand nombre de solutés parasites perturbant la séparation

LC (pour Liquid Chromatography)

  • Processus séparatif continu
  • Analytes de polarités et structures voisines
  • Solutions injectées relativement propres

LC prep & Flash

  • Processus séparatif continu
  • Analytes de polarités et structures voisines
  • Mélanges à purifier plus ou moins propres
 Chromatographie
(HPLC, prep LC, Flash)
Extraction
(SPE,SLE)
Processus séparatifContinuDiscontinu
Solutés dans la colonneToujours en mouvementBloqués puis décrochés
Composition phase mobileSoit constante (analyse isocratique)
Soit changée continûment (gradient)
Changée pas à pas
Type de séparationChromatographie d’élutionChromatographie frontale
Volume de la colonne occupé:
par les analytes
par la seule phase mobile
1 à 2 % (HPLC)
99-98 %(HPLC)
100 %
0 %
Constituants de l’échantillonSolutés de polarités voisinesSolutés de polarités différentes
UtilisationRéutilisable« One Shot »
Coût de fonctionnementMoyen à élevéFaible
Coût de l’appareillageElevéFaible

 

2. SPE & HPLC > Définitions

SPE

Elle sert à pré-séparer des solutés de structures différentes et à les recueillir dans un minimum de solvant. D’où les longueurs très courtes des cartouches de SPE. Pour que la SPE sépare les solutés d’intérêt, on doit travailler avec des facteurs de sélectivité supérieurs à 4. Le mode step gradient facilite la séparation. La SPE est une chromatographie fonctionnant à très grande sélectivité.

HPLC

Compte tenu de l’efficacité des supports de petit diamètre de particules et des longueurs de colonnes usuelles, on percolera la colonne en continu par la phase mobile et on séparera facilement des solutés avec un facteur de sélectivité de 1,05.
En conclusion, les lois permettant de choisir la phase mobile sont les mêmes en LC et en SPE mais elles seront utilisées selon des critères différents.

 

3. Caractéristiques des phases stationnaires utilisées en HPLC, Flash et SPE

 HPLCFlashSPE
Diamètre des particules1,7 à 10 µm15 – 50 µm30 à 140 µm
Compacité du remplissageForte15 – 50 µmForte
Effets extra colonneFaibles (si optimisés)– – –Forts
Longueur de colonne3 à 30 cm5 à 50 cm~ 1 à 2 cm
Efficacité (Nombre de plateaux)5000 à 60001000- 5000~ 10 à 50
Sélectivité nécessaireFaibleMoyenneForte
Polarité des analytesPeu différentePeu différenteTrès différente
Diamètre des pores60 – 150 Å60 – 150 Å60 – 150 Å
Surface spécifique50 – 450 m2/g50 – 450 m2/g500 – 1500 m2>/g

Réalisée en collaboration avec l’Université Paris-Sud, Pr A. Tchapla & Dr S. Héron, LETIAM, IUT d’Orsay, Orsay, France.

 

4. Influence de la taille des particules

En SPE, le diamètre des particules varie de 30 à 140 μm, les longueurs de lit de 1 à 2 cm.

En HPLC, le diamètre des particules est compris entre 1,7 et 5 μm, les longueurs classiques de colonne entre 5 et 25 cm.

En prep LC et Flash, le diamètre des particules varient de 10 à 50 μm, les longueurs des colonnes de 5 à 50 cm.

Pour une même phase stationnaire, si seul le diamètre de particules diffère (mêmes solutés, même phase mobile, même température) :

  • la rétention et la sélectivité ne seront pas affectées
  • la résolution sera changée (les longueurs des colonnes affectent également le nombre de plateaux).
Efficacité théoriqueØ des particulesApplications
5 000 plateaux/m50 µmFlash purification
SPE
20 000 plateaux/m15 µmFlash purification
SPE
prep LC
33 000 plateaux/m10 µmprep LC
80 000 plateaux/m5 µmAnalytique
130 000 plateaux/m3 µmAnalytique
180 000 plateaux/m2,2 µmAnalytique
UHPLC
220 000 plateaux/m1,7 µmUHPLC

Classiquement une colonne d’HPLC analytique de longueur 25 cm, remplie de particules de 5 µm développe une efficacité de l’ordre de 20 000 plateaux en routine. Une cartouche de SPE de longueur 1,25 cm remplie de particules de 50 µm développe une efficacité de l’ordre de 50 plateaux.

Laisser un commentaire    




Nano-Anticorps, de nouveaux outils pour l’analyse des protéines, les immunoessais et la thérapie médicamenteuse


Un peu d’histoire

Camel

A la fin des années 80, au cours de travaux pratiques d’extraction d’immunoglobulines, deux étudiants utilisèrent des échantillons de sérums de dromadaires congelés à la place d’échantillons humains qu’ils craignaient être contaminés par le VIH. Quelle ne fût pas leur surprise de visualiser en plus des habituelles immunoglobulines un groupe d’anticorps plus petits qui ne correspondait à rien de connu.

Ne croyant pas un des anticorps variants ou dégradés mais à des anticorps à part entière, deux chercheurs entreprirent de les caractériser. Ils mirent au jour des anticorps dépourvus de chaîne légère et possédant un seul domaine de reconnaissance antigénique, constituant une nouvelle classe, car mis en évidence chez d’autres espèces de camélidés dont les Lamas et les Alpagas.

 

Structure des Nanocorps

Les anticorps de camélidés sont appelés nanocorps (de l’anglais Nanobody), ou anticorps à chaîne lourde (hcAb). En effet, ils sont très petits, car composés d’une seule chaîne lourde. Ils sont dépourvus de chaîne légère ce qui implique que le fragment Fab (fragment antigen binding) de ces anticorps est réduit à un seul domaine variable (VHH : domaine variable des anticorps à chaîne lourde). Ils ne pèsent qu’environ 15 kDa et n’occupent que 4 nm de long et 2.5 nm de large, bien moins que les anticorps conventionnels (150-175KDa) et leurs fragments, Fab (~50 kDa) et scFv (~25 kDa) !

Structure des Nanocorps

Avantages des Nanocorps

La plupart des avantages résultent de leur petite taille :

  • Ces nanocorps sont capables d’atteindre des épitopes cryptiques des cibles, souvent inaccessibles aux anticorps traditionnels 10x plus gros.
  • La stabilité thermique et chimique des nanocorps est bien meilleure que celle des anticorps traditionnels. La solubilité est aussi améliorée. Ce qui permet leur emploi en conditions extrèmes, et de les délivrer in vivo par voie orale et peut-être oculaire, en plus de l’injection intraveineuse et sous-cutanée.
  • Les nanocorps peuvent également être facilement conjugués, par ex avec des agents tueurs de cellules ou des fluorophores.
  • Injectés in vivo, le nanocorps présente une pharmacocinétique très favorable notamment pour l’imaging (élimination rapide par les reins).
  • Dernier point, mais non le moindre, les nanocorps sont beaucoup plus faciles à produire à partir d’une variété d’hôtes (par génie génétique). Ils peuvent aussi être modifiés (humanisés).

Il a été signalé que par ex in vivo, l’élimination des nanocorps par les reins peut masquer le signal d’une cible proche, ou être trop rapide pour permettre une bonne la fixation du nanocorps sur ses cibles. Le marquage fluorescent peut affecter les propriétés de fixation du nanocorps. Des solutions ont néanmoins aussi été proposées pour limiter ces inconvénients.

 

Nanocorps recombinants, des outils avérés et d’avenir prometteur

Les nanocorps peuvent être beaucoup plus que de simples réactifs. Leur obtention par des techniques génétiques et d’expression phagique permet de les cloner, de les sélectionner (phage collections) et de les façonner (constructions), pour optimiser leur affinité, spécificité, solubilité (mutation aa dans le FR2), et aussi de les fonctionnaliser (humanisation, vectorisation, …). Les applications se diversifient, et le futur s’annonce prometteur du diagnostic au thérapeutique. Vous trouverez ci-dessous quelques exemples de leurs utilisations.

Intérêt en recherche : en imagerie, pour l’étude des fonctions des protéines

En 2006 une équipe de chercheurs a, en créant une nouvelle construction appelée « chromobodies » ( nanocorps liés à des protéines fluorescentes), pu suivre en temps réel les cibles intracellulaires endogènes dans les cellules vivantes. Ainsi, grâce à ces constructions, les biologistes peuvent observer de façon dynamique en temps réel les actions de leur protéine d’intérêt.

Les applications, en recherche et à terme en diagnostic, sont bien plus larges : le nanocorps ainsi produits combinés à une protéine fluorescence (gfp) constitue des sondes de petite taille très utile en imagerie moléculaire (notamment SPECT et PET), et en screening.

Les nanocorps ciblant des antigènes intracellulaires (cytosoliques) ont un potentiel particulier en biologie moléculaire de la cellule, et à terme pour identifier de nouvelles cibles diagnostiques ou thérapeutiques : pour étudier l’expression des protéines, ils permettent une imagerie à haute résolution que ne permettent pas les techniques de silencing (down regulation) ou knock-down (Van Audenhove et al., 2014). Ils permettent de mieux corréler la localisation et la fonction des protéines étudiées, jusqu’à l’étude d’interactions protéine-protéines (avec des nanocorps reconnaissant la GFP). Les conditions de pénétration membranaire, et par ex de la barrière hémato-céphalique, restent à investiguer.
L’utilisation de nanocorps a permis l’identification de nouveaux biomarqueurs tumoraux comme par exemple les biomarqueurs de tumeur cérébrale TRIM28 et beta-actin identifiés après analyse en spectrométrie de masse, de complexes nanocorps-antigènes issus d’échantillons de glioblastome multiforme (GMB) (Jovcevska et al., 2014).

Enfin, les nanocorps peuvent améliorer les immuno-tests (Pab, Mab), de par leur haute spécificité, leur stabilité supérieurs, et leur meilleure cinétique. Ils se prêtent aussi aux tests cellulaires ainsi qu’aux immunoPCR.
Leur stabilité a été mise à profit dans des processus requérant des conditions extrêmes de température, de pH ou de force ionique comme le biomarqueur AFP (l’alpha-foetoprotéine) (Chen et al., 2016).

 

Intérêt en immunodiagnostique et thérapeutique

Plusieurs avantages des nanocorps décrits ci dessus en R&D s’appliquent en particulier à l’immunodiagnostique (spécificité, stabilité). Ils peuvent être marqués par des chélates et radioéléments (pour du RIA) ou des fluorophores (pour de la microscopie, de la cytométrie ou du microresau, mais aussi de l’imagerie par scintigraphie, optique, ou par ultrasons). Ainsi, la limite de détection du dosage de l’AFP, biomarqueur de nombreux cancers) passe de 1µg/ml à 0.47ng/ml lorsque des nanocorps anti-AFP sont utilisés (Patris et al., 2014), cette limite peut descendre à 0.0005ng/ ml en immuno-PCR (Chen et al., 2016).

De nombreux projets utilisant des nanocorps sont déjà engagés dans le domaine thérapeutique, comme agent neutralisant d’enzyme ou récepteur, ou comme vecteur d’agent toxique (radioélément, toxine) ou d’agent bioactif (médicament) ciblé sur un organe cible (par ex cancéreux). En octobre 2017, l’entreprise pharmaceutique Ablynx a annoncé des résultats positifs pour son produit de première intention, le caplacizumab, un médicament à base de nanocorps et nanoparticule, issu d’un essai de phase III sur le purpura thrombocytopénique thrombotique acquis (aTTP). Un avantage particulier des nanocorps comparés aux monoclonaux, est de mieux pénétrer les tumeurs, et à terme les cellules (intracorps : voir tableau suivant).

 

Etat de l’art : applications et avancées utilisant les nanocorps

Le tableau ci-dessous est une vue d’ensemble des applications basées sur l’utilisation des nanocorps, leurs avantages et leurs inconvénients lorsqu’ils sont appliqués en tant que produits thérapeutiques, molécules de libération de médicaments, intracorps, outils de diagnostic et/ou d’imagerie, ainsi que les voies de développements actuels.

Nanocorps contre les cibles extracellulaires

Construction :Avantages :
Récepteurs comme cible
EGFR, HER2, c-MET, VEGFR, DR5, CXCR4 / 7
Ligands comme cible
HGF, VEGF, uPA, CXCL11 / 12
Blocs de construction de domaine excellents
Accumulation profonde et homogène dans les tumeurs
Nouveaux épitopes cibles
Limitations :Solutions :
Faible affinité
Elimination rapide dans le sang
Manque d’un fragment Fc Immunogénicité
Constructions multivalentes de nanocorps
Fusion à des nanocorps anti albumine
Addition d’une queue Fc
Humanization
Statut actuel : 
In vitro +++
In vivo:
Xenogreffes ++
Essais cliniques +
Potentiel Thérapeutique

 

Nanocorps pour la libération de médicaments

Construction :Avantages :
Cibles :
VEGFR2, EGFR, c-MET, HER2, MUC1
Libération de toxines
Pseudomonas exotoxin A
Particules de libération
Liposomes, micelles, NANAPs,
polymersomes, polyplexes
Convient pour la conjugaison
Pas de queue Fc
Accumulation tumorale rapide
Peut agir lui-même antagoniste
Limitations :Solutions :
Faible solubilité et / ou stabilité des médicaments
Elimination sanguine rapide affectant principalement la cellule en croissance ou en prolifération
Encapsulation dans des nanoparticules
PEGylation
Viser l’effet de la mort cellulaire
Statut actuel : 
In vitro +++
In vivo :
Xenogreffes ++
Essais cliniques /
Potentiel Thérapeutique

 

Étude fonctionnelle des protéines intracellulaires (intracorps)

Construction :Avantages :
Cibles :
intracellulaires Fascine, cortactine, CapG β caténine, PKCε Vimentine, GFP
Stabilité et activité intracellulaire
Modulation spécifique du domaine/fonction
Facile à fusionner : Aide à la découverte de médicaments
Limitations :Solutions :
Pénétration de la membrane cellulaire requise pour l’usage thérapeutiqueUtilisation d’E.coli enteropathogenic (EPEC)
Nanocorps pénétrant spontanément
Statut actuel : 
In vitro +++
In vivo :
Xenogreffes ++
Applicable pour la recherche en biologie cellulaire

 

Outils de diagnostic (marqueurs du cancer)

Construction :Avantages :
Cibles de biomarqueurs extracellulaires
AFP, CAIX, PMSA
TAG-72, HER2
Grande stabilité
Facile à conjuguer Convient dans plusieurs applications: ELISA, PCR, IHC
Petite taille, propice pour le format puce
Révéler de nouveaux biomarqueurs intracellulaires en IHC
Limitations :Solutions :
Performance accrue souhaitéeSpécifique de l’application
Utiliser un mélange de nanocorps
Statut actuel : 
In vitro +++Applicable pour le diagnostic

 

Imagerie moléculaire

Construction :Avantages :
Cibles
PMSA, MMR, HER2, HGF, VCAM1, CAIX, EGFR
Marqueur
99mTc, 177Lu, 111In, 123I, 68Ga, 89Zr, 124I, 131I
Micro/nanobulles
IRDye800CW, IRDye700DX
Accumulation dans la tumeur rapide et homogène
Elimination sanguine rapide
Conjugaison facile
Imagerie précoce, procédure sûre
Combinaison imagerie et thérapie possible
La chirurgie guidée par l’image devient possible
Limitations :Solutions :
Accumulation dans les reins
Accumulation dans le foie et la rate
Accumulation dans le foie et les intestins
Supprimer l’His-tag
Co-injecter de la gelofusine et / ou de la lysine
Changer d’agent chélateur
Construction spécifique de nanocorps à administrer non marqué
Statut actuel : 
In vitro +++
In vivo :
Xénogreffes +++
Modèles de souris in vivo +++
Essais cliniques + (réussi)
Applicable pour l’imagerie
Potentiel à identifier de nouvelles cibles thérapeutique

D’après I. Van Audenhove, J. Gettemans / EBioMedicine 8 (2016) 40–48

 

Des anticorps de lama comme outils pour la R&D

LamaLes Nanocorps sont utilisés pour leur réaction spécifique sur les antigènes cibles, dans divers immunoassays, imagerie cellulaire et de l’immuno-targetting.

La partie Fc (heavy chain – non spécifique) est utilisée comme un tag (marqueur) que l’on fusionne à une protéine (recombinante) par fusion génétique. Ces LamaFc-Protéines servent d’immunogènes (pour de l’immunisation), et peuvent aussi servir comme antigène marqué dans divers immunoassays (en coating, ou en utilisant des anticorps secondaires -anti Ig de Lama-).

Toujours à l’écoute de la recherche, Interchim® offre désormais des protéines recombinantes liées à des nanocorps de Lama. La plupart de ces protéines sont des cibles thérapeutiques pour la recherche actuelle et future.
Des immunoréactifs issus des hcAbs de Lama sont aussi proposés.

 

En savoir plus :

Laisser un commentaire    




Anticorps de Lama et protéines taggées IgG Fc de lama


LamaLes anticorps de camélidés fournissent des outils biotechnologiques uniques en recherche (Anticorps entiers ‘hcAbs’, et fragment VHH ou ‘Nanobodies’), avec des applications prometteuses du diagnostique au thérapeutique.

Un peu d’histoire à propos des nanocorps

En 1993, de jeunes chercheurs ont découvert une nouvelle classe d’anticorps à domaine unique chez des chameaux. Ce nouveau type d’anticorps à chaîne lourde (hcIGs ou hcAbs) contient un seul domaine variable (VHH) et deux domaines constants (CH2, CH3). Cette forme rare d’anticorps se prête à la production du fragment spécifique VHH, le nanocorps qui est une alternative fascinante aux anticorps conventionnels.
Ces nanocorps peuvent être produits par immunisation classique d’animaux camélidés, mais aussi par génie génétique.
Ils présentent un intérêt tant en recherche (de l’analyse in vitro à l’imagerie moléculaire) qu’en diagnostic (comme sonde) et thérapeutique (comme médicament potentiel).

Principaux avantages des nanocorps :

  • En raison de leur petite taille, les nanocorps peuvent se lier à des épitopes difficiles d’accès aux anticorps traditionnels. Ils pénètrent aussi mieux les cellules et permettent de détecter ainsi des cibles intracellulaires ou masquées.
  • La stabilité des nanocorps est bien meilleure que celle des anticorps traditionnels.
  • Les nanocorps peuvent être facilement conjugués pour les fonctionnaliser
    (avec des agents fluorescents pour détecteur leur cible, avec des agents toxiques pour les adresser à des cellules et les tuer, ou avec des protéines, des résines, …)
  • Les nanocorps sont plus faciles à produire et modifier/optimiser
    par génie génétique, à partir d’une variété d’hôtes, de façon contrôlée.

Les Nanocorps sont utilisés pour leur réaction spécifique sur les antigènes cibles dans divers immunoassays, imagerie cellulaire et de l’immuno-targetting.
La partie Fc (heavy chain – non spécifique) est utilisée comme un tag (marqueur) que l’on fusionne à une protéine (recombinante) par fusion génétique. Ces LamaFc-Protéines servent d’immunogènes (pour de l’immunisation), et peuvent aussi servir comme antigène marqué dans divers immunoassays (en coating, ou en utilisant des anticorps secondaires -anti Ig de Lama-).

 

Protéines fusionnées avec les IgG Fc de lama :

Concues pour de l’immunisation (et d’autres applications: immuno-targetting, immunoassays)

  • Immunogénicité de la protéine taguée améliorée : Le tag ‘IgGFc’ a une faible immunogénicité, mais il peut favoriser la dimérisation des protéines
  • Pharmacocinétique : longue demi-vie et bonne stabilité
  • Haute pureté (Fig 1)
  • Haute activité (Fig 2)
  • Faible taux d’endotoxine (< 10 UE / mg).
Lama IgG2b Fc tag HumaineLama IgG2b Fc tag Humaine-2
Fig 1 : PD-1, Llama IgG2b Fc tag humaine (#PD1-H5259 ) sur SDS-PAGE dans des conditions dénaturantes (R). La pureté de la protéine est supérieure à 95%.BAFF His Tag humaine immobilisée, (#BAF-H5248 ) à 5 μg/mL (100 μL/puits) peut se lier à la BCMA Llama IgG2b Fc Tag Humaine, ( BCA-H5259 ) plage de 0,02-0,4 ng/mL.

 

> Liste des protéines conjuguées avec le tag lama IgG Fc (exclusif) :

MoleculeCat. No.Product DescriptionStructure
BCMABCA-H5259Human BCMA, Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructure BCMA
CD19CD9-H5250Human CD19 (20-291), Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructure CD19
CD30TN8-5250Human CD30, Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructure CD30
CD38CD38-H5252Human CD38, Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructureCD38
CD47CD7-H5251Human CD47, Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructure CD47
LAG-3LA3-H525cHuman LAG-3, Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructure LAG-3
PD-1PD1-H5259Human PD-1, Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructure PD1
PD-L1PDL-H5250Human PD-L1, Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructure PD-L1
Siglec-2SI2-H525aHuman Siglec-2, Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructure Siglec
Siglec-3CD3-H5259Human Siglec-3, Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructure Siglec-3

Accédez à plus de protéines recombinantes taggées LlamaFc.

 

Pour une utilisation future de biopanning en phage display, les protéines biotinylées correspondantes sont recommandées. Ces protéines peuvent être fixées à des surfaces recouvertes de Streptavidine (ex Microplaques ELISA) pour du criblage à haut débit.

> Liste des protéines conjuguées avec le tag lama IgG Fc (exclusif) :

MoleculeCat. No.Product DescriptionStructure
BCMABC7-H82F0Biotinylated Human BCMA / TNFRSF17 Protein, Fc Tag, Avi Tag (Avitag™)Structure BCMA Fc Avitag
CD30CD0-H82E6Biotinylated Human CD30 / TNFRSF8 Protein, Avi Tag (Avitag™)Structure CD30 Avi His Fc
CD38CD8-H82E7Biotinylated Human CD38 Protein, Avi Tag (Avitag™)Structure D38 Avi His
CD47CD7-H82E9Biotinylated Human CD47 Protein, Avi Tag (Avitag™)Structure CD47 His Avi
LAG-3CD7-H5251Biotinylated Human LAG-3, Mouse IgG2a Fc Tag, (Avitag™)Structure LAG-3 mFc Avi
PD-1LA3-H525cBiotinylated Human PD-1, (recommended for biopanning)Structure PD-1 Avi His
PD-L1PD1-H5259Biotinylated Human PDL-1/B7-H1, (recommended for biopanning), Avi Tag (Avitag™)Structure PD-L1 Avi His
Siglec-2PDL-H5250Biotinylated Human Siglec-2, Fc Tag, (Avitag™)Structure Siglec-2 Fc Avi
Siglec-3SI2-H525aBiotinylated Human Siglec-3 / CD33 Protein, (Avitag™)Structure Siglec-3 Avi His

Accédez à plus de protéines recombinantes Avi-taggées.

 

Immunoréactifs de lama :

> Anticorps secondaires de Lama

Les anticorps de lama immunisés envers des IgG de différentes espèces et purifiés par affinité puis marqués par différents marqueurs fluorescents, la biotine ou l’HRP, sont utilisés dans les immunoassays.

Llama AbAnti Mouse IgG(H+L)
Lyo(1mg) or 2mg/ml (50&500μl)
Anti Rabbit IgG(H+L)
Lyo(1mg) or 2mg/ml (50&500μl)
CF488A204542449
CF5682045520450
CF5942045620451
CF640R2045720452
CF6472045820453

 

> Anticorps de Lama immobilisés

Llama Igg Coupled 4% Agarose Beads OOIB00006, 2 ml

 

> Anticorps de Lama pour Controles

 Unconj.BIOTINFITCHRP
Control Normal Llama IgGXR-8001XR-8013XR-8005XR-8009
Control Normal Llama IgG1XR-8002XR-8014XR-8006XR-8010
Control Normal Llama IgG2XR-8004XR-8016XR-8008XR-8012
Control Normal Llama IgG3XR-8003XR-8015XR-8007XR-8011

 

> Sérum et Ig de Lama

Normal Llama serumOOIB00013, 2mlOOIB00012, 10ml
Llamma IgOOIB00043, 10mg– – –
Llamma IgGOOIB00044, 10mg– – –

 

> Anticorps secondaires anti Ig de Lama

Anti-Llama IgG (H+L)Goat antiRabbit anti
Unconjugated41R-1045, 1 mg41R-1046, 1mg
HRP43R-1284, 1 mg43R-1290, 1mg
AP43R-1281, 500 μg43R-1287, 500 μg
Biotin43R-1282, 1 mg43R-1288, 1 mg
FITC43R-1283, 1 mg43R-1283, 1 mg
Rhodamine43R-1285, 1 mg– – –
RPE13415, 1 unité– – –
APC13393, 1 unité– – –

Accédez à plus d’immunoréactifs et anticorps de Lama.

 

En savoir plus :

  • Voir l’article Nano-Anticorps
  • N’hésitez pas à nous demander des produits & services similaires: Camel/Alpaga antibodies, custom production, antibody purification …

A savoir que les VHH peuvent être produits à partir d’une large gamme d’immunogènes (nucléotides naturel ou modifié, peptide avec ou sans modification post-traductionnelle, protéine, microorganisme, haptènes…).

Cela passe par l’immunisation de lamas, puis la construction d’une bibliothèque de phage display (phages comportants l’ADNc codant pour le VHH qui sont utilisée pour présenter les VHH dans des tests), la sélection des phage/VHH d’interêt, et enfin la production (qui peut être à grande échelle).

Les nanocorps ont une plus grande stabilité que les anticorps classiques,
. conformationnelle et thermique (jusqu’à 60°C / 140°F)
. et chimique (il supportent une plus large gamme de pH).

Laisser un commentaire    




L’effet de la température sur la chimie de PhotoRedOx


Le contrôle de la température des réactions de photoredox n’est pas facilement réalisable. La plupart des protocoles sont décrits en utilisant un ventilateur pour maintenir la réaction proche de la température ambiante et en n’utilisant pas le ventilateur pour laisser la réaction monter en température. De plus, il y a très peu de systèmes décrits permettant à la réaction de se dérouler en-dessous de la température ambiante. Dans ce contexte, il est très difficile d’étudier l’effet de la température sur la photocatalyse de manière pratique.

PhotoRedOx TCHepatoChem a développé un appareil le PhotoRedOx TC (Température Contrôlée) qui permet ce type d’expériences faciles à mettre en œuvre en utilisant un simple circulateur de fluide refroidissant ou chauffant.
Le PhotoRedOx TC (Température Contrôlée) est compatible avec de nombreuses sources lumineuses comme par exemple les différentes LEDs EvoluChem 18W. Il dispose d’une chambre de photochimie permettant une distribution uniforme de la lumière. On peut utiliser plusieurs formats de flacons (de 0.3ml à 20ml) grâce à différents portoirs. Le réacteur de chimie en continue peut également être utilisé avec cet appareil. Sont nécessaires à l’utilisation du PhotoRedOx TC une plaque agitatrice magnétique pour assurer l’agitation et un circulateur de fluide externe afin de chauffer ou refroidir les flacons réactionnels. (les sources lumineuses, les portoirs, le réacteur de chimie en continue, la plaque agitatrice et le circulateur de fluide sont fournis indépendamment)

Dans les exemples suivants, HepatoChem montre comment l’alkylation CH utilisant un réactif BF3K peut tirer profit d’une température plus basse ; et comment l’augmentation de la température peut accroître le rendement d’une réaction de cross-coupling C-O.

 

PhotoRedOx TC (Température Contrôlée)

  • Compatible avec beaucoup de sources lumineuses (EvoluChem 18 W)
  • Chambre de photochimie permettant la distribution uniforme de la lumière
  • Compatible avec plusieurs formats de flacons (de 0.3mL à 20mL)
  • Réacteur de chimie en continue disponible
  • Agitation sur une plaque agitatrice magnétique
  • Circulateur de fluide externe nécessaire pour chauffer ou refroidir les flacons réactionnels

 

Réaction Cyclopropyl BF3K et Hydroquinine

Reaction_Cyclopropyl BF3K & Hydroquinine

Rendement de la réaction à 19°C, 28°C et 50°C

Reaction_Cyclopropyl BF3K & Hydroquinine

Détails expérimentaux : La réaction est réalisée dans la PhotoRedOx Temperaure Controlled EvoluChem avec un bain circulant de Polyethylene glycol/Eau et une LED EvoluChem 18W 6200K white pendant 2 h. Cette réaction contient 50 µmol de substrat,
1.5 équiv. de BF3K, 2 équiv. de K2S2O8, 5 équiv. TFA et 2 mol% Ir(dF-CF3-ppy)2(dtbpy) dans 0.5ml de DMSO.

 

Couplage C-O avec le cyclohexanol

Couplage_C-O_avec_cyclohexanol

Couplage_C-O_avec_cyclohexanol-2

Détails expérimentaux : La réaction est réalisée dans la PhotoRedOx Temperature Controlled EvoluChem avec une LED EvoluChem 450nm.
Réaction : 2 mol% Ir(dF-CF3-ppy)2(dtbpy), 5 mol% NiCl2-dme/dtbpy et 3 équiv. base avec 10 mol% quinuclidine. Le rendement a été déterminé par LC-UV.

En savoir plus :

Laisser un commentaire    




Guide : Préparation d’échantillons & filtration, comment bien choisir vos membranes pour optimiser cette étape


1. De l’importance de la filtration pour réussir vos préparations d’échantillons

Etape indispensable de la préparation d’échantillons, la filtration permet, par passage à travers une membrane spécifique, de débarrasser un fluide des particules solides qui s’y trouvent en suspension.

Elle recouvre des domaines d’application divers et variés :

  • En biologie ou biochromatographie, cette technique permet d’éliminer des virus, des bactéries voire même d’isoler d’une matrice des protéines à fortes masses moléculaires. Pour cela, des filtres stériles sont couramment utilisés.
  • En chromatographie ou en chimie, que ce soit dans le  pharmaceutique, la cosmétique, l’agrochimie ou l’environnement…, on parle de filtration de matières en suspension insolubles. L’utilisation de la filtration limite la détérioration précoce des consommables (GC-HPLC).

L’utilisation d’automates adaptés permet le traitement rapide d’un très grand nombre d’échantillons. Ainsi, il est possible de réaliser de 96 jusqu’à 384 filtrations en simultané sur une même plaque.

D’autres fabricants comme Sotax ou Zymark proposent des automates de filtration utilisant des filtres seringues à géométrie spécifique, pour la filtration d’échantillons issus de la dissolution de formulations pharmaceutiques.

Moins onéreuse, la filtration manuelle sur filtres seringues, papiers ou membranes filtrantes reste la plus utilisée dans les laboratoires pour traiter des échantillons liquides ou des solvants. Ces produits répondent aux besoins d’un grand nombre d’utilisateurs.

Les filtres sans seringue ou vial filtrant sont les dernières innovations en terme de filtration. Ils réduisent considérablement le temps de préparation des échantillons et peuvent directement s’insérer sur les auto-échantillonneurs couplés aux systèmes d’analyses.

Organigramme Filtration

 

2. Les critères à prendre en compte pour le choix de vos membranes

La porosité de la membrane définit le seuil de filtration, c’est-à-dire le diamètre maximum des particules qui pourront la traverser. Elle varie généralement entre 5 et 0,20 μm. Le choix du diamètre du filtre et de la porosité de la membrane doit toujours tenir compte du volume de l’échantillon et du type d’analyse qui sera pratiquée ultérieurement. Une porosité de filtration de 0,45 μm est nécessaire pour tous les solvants et échantillons avant une  analyse HPLC. Cette précaution limite les problèmes de montée en pression des systèmes. Pour l’utilisation de colonnes dont le diamètre de particules est inférieur à
3 μm, une filtration à 0,2 μm devient obligatoire.
En chromatographie gazeuse, l’encrassement de l’insert d’injection est limité si l’échantillon est correctement filtré.
Pour la filtration de matrices chargées, les filtres seringues munis d’un pré-filtre diminuent les problèmes de colmatage de la membrane et évitent ainsi leurs multiples remplacements durant la filtration.

 

3. Le guide de sélection

Cellulose régénérée (RC)

Membrane hydrophile ayant les mêmes propriétés que l’acétate de cellulose mais stable avec la plupart des solvants HPLC. Elle peut être utilisée pour la filtration ou le dégazage des solvants HPLC. Elle est compatible avec les solutions aqueuses dans une fourchette de pH comprise entre 2 et 12. C’est un matériau de choix pour la filtration des protéines lorsqu’un taux de récupération maximum est nécessaire, il présente un très faible taux d’adsorptions non spécifiques.


Esters de cellulose (MEC)

Membrane idéale pour filtrer les échantillons en solutions aqueuses. Faible résistance aux solvants. Avec préfiltre en fibre de verre, elle est utilisée pour la filtration des milieux de cultures et des échantillons biologiques ainsi que pour la clarification et la stérilisation des solutions aqueuses. Très faible adsorption des protéines (adsorption inférieure aux membranes PVDF et Polysulfone). Le préfiltre en fibre de verre multiplie par 3 le volume filtrable.


Nylon et Nylon Low Extractibles (LE)

Membrane fréquemment employée pour la filtration des échantillons HPLC avant injection.
Bonne résistance aux solvants. Caractéristiques hydrophiles, donne de bons résultats avec les solutions aqueuses. Déconseillée pour la filtration des protéines lorsqu’un taux de récupération maximum est nécessaire.


Polypropylène (PP)

Très résistante, peut être utilisée avec tous les solvants et acides. La résistance d’un filtre à coque de polypropylène est limitée par la résistance de la membrane filtrante.

 

PVDF

Membrane hydrophobe ayant une bonne résistance aux solvants. Elle est excellente pour la filtration des solvants HPLC, de même que pour la plupart des solutions biologiques. La membrane PVDF est considérée comme étant celle qui présente le plus faible taux d’adsorption de protéines.


PVDF-HLC (hydrophile)

Membrane hydrophile, sans extractibles, ayant une très bonne compatibilité avec les solutions 100% aqueuses. Elle présente un très faible taux d’adsorption des protéines et est par conséquent recommandée pour la filtration des milieux biologiques.


PTFE

Membrane hydrophobe, chimiquement résistante aux solvants, acides et bases. La membrane PTFE ne relargue pas d’impuretés dans le filtrat. Elle est idéale pour la filtration des solvants HPLC non aqueux.


PTFE-HLC (hydrophile)

Membrane hydrophile, sans extractibles, ayant une très bonne compatibilité avec les solutions aqueuses et organiques. Haute résistance au pH et à la température, faible taux d’adsorption des protéines.

 

Fibres de verre (GMF/GF)

Couramment utilisées comme préfiltre dans la plupart des filtrations. Certaines de ces membranes sont employées pour le lavage et la purification de DNA.


Polyéthersulfone (PES)

Membrane hydrophile avec un très faible taux d’adsorption pour les protéines et acides nucléiques. Très forte résistance mécanique de la membrane permettant la filtration rapide de grand volume d’échantillon. Dédiée principalement à la filtration de cultures cellulaires. Compatible avec les alcools et bases fortes.


Nitrocellulose (NO2)

Membrane hydrophile recommandée pour la clarification et filtration d’échantillons aqueux au même titre que les membranes en MEC.

 

Acétate de cellulose (CA)

Membrane hydrophile fréquemment utilisée pour la filtration de solutions aqueuses.
Elle présente un très faible taux d’adsorption protéique. Sa résistance chimique aux solvants est moins importante que celle des membranes RC.

4. Pour rappel :

PTFE : Polytétrafluoroéthylène
PTFE-HLC : Polytétrafluoroéthylène hydrophile
PVDF : Polyvinylidine difluoride
PVDF-HLC : Polyvinylidine difluoride hydrophile
RC : Cellulose régénérée
MEC : Mélange d’esters de cellulose
PES : Polyéthersulfone
NO2 : Nitrocellulose
GF : Fibre de verre
GMF : Micro fibre de verre
Nylon : Polyamide 6
Nylon LE : Nylon à faible taux d’extractibles
PP : Polypropylène
PP-2 : Polypropylène hydrophile
PE : Polyéthylène
UH-PE : Polyéthylène haute densité
CA : Acétate de cellulose

En savoir + :

– Nos instruments
– Nos produits

Laisser un commentaire    




Place à la magie : Nous vous souhaitons un très joyeux noël


Laisser un commentaire    




Refroidir un milieu réactionnel : problématiques et solutions


Les solutions actuelles pour refroidir un milieu réactionnel :

Certaines réactions chimiques ont besoin d’être réalisées à basses températures sur de longues périodes.
Pour répondre à ces besoins, plusieurs solutions sont actuellement envisageables telles que :

L’utilisation d’un mélange glace – sel

Températures minimales auxquels peuvent descendre les mélanges glace -sel :

  • T ~ 0°C : bain de glace
  • T ~ -10°C : bain de glace (70 %) + chlorure de calcium (30 %)
  • T ~ – 15 °C : bain de glace (80 %) + chlorure d’ammonium (20 %)
  • T ~ – 20°C : bain glace (75 %) + chlorure de sodium (25 %)

Les pourcentages sont donnés en masse

 

L’utilisation d’un mélange solvant organique – carboglace

On peut obtenir aussi des mélanges en réalisant un mélange entre dioxyde de carbone en paillettes (carboglace ou neige carbonique) avec des solvants organiques :

  • T ~ – 23°C : tétrachlorure de carbone/ carboglace
  • T ~ – 60°C : chloroforme/ carboglace
  • T ~ – 78°C : acétone/ carboglace
  • T ~ – 95°C : toluène/ carboglace
  • T ~ – 100°C : éther/ carboglace

 

L’utilisation d’air ou de l’azote liquide ou solvant organique / azote liquide.

  • T ~ – 170 – 180°C

 

Les précautions à prendre et contraintes rencontrées :

Des précautions devront également être considérées pour le maintien de ces basses températures telles que :

  • Isoler thermiquement le système de synthèse utilisé, soit en le recouvrant d’un isolant.
  • Utiliser un Dewar ou un Cool-It.

Malgré toutes ces solutions et précautions, la stabilité de la température du milieu réactionnel ne pourra pas être garantie ce qui peut être gênant pour la réalisation de certains composés comme les acides boroniques.
Les acides boroniques peuvent être obtenus selon une réaction qui consiste à former un magnésien ou un lithien puis à l’additionner sur un ester d’acide borique (Schéma 1) et enfin à hydrolyser l’ester arylboronique obtenu pour récupérer l’acide boronique

Schéma 1 - Addition d’un arylmétallique sur un trialkylborate

Les acides boroniques obtenus à partir d’organolithiens présentent l’avantage de préparer les aryllithiens par ortholithiation, en s’affranchissant du précurseur halogéné.

Il a été aussi été montré que, dans certains cas d’organolithiens peu stables, il est possible de réaliser un piégeage in situ, en ajoutant la base lithiée sur un mélange d’arène et de borate (Schéma 2).

Schéma 2 - Borylation par ortholithiation et piégeage in situ.

Une des limites, pour l’ortholithiation, est que cette réaction doit toujours être réalisée à très basse température (de -78°C à -40°C)  à laquelle risque de s’ajouter les limites liées aux outils actuels, proposés pour travailler à basse température.

Pour des réactions se faisant sur de longues durées et toujours à très basse température, la nécessité d’une surveillance à cause du rechargement fréquents en mélange carboglace /solvant ou azote liquide /solvant par les utilisateurs peut vite devenir contraignant et fastidieux.

 

Repousser les limites avec des solutions efficaces :


Pour repousser ces limites et arriver à réaliser des applications selon des conditions spécifiques à basses températures et sur de longues durées, Interchim propose des solutions efficaces.

Par exemple, pour les applications où la stabilité de la température, l’efficacité de l’agitation sont exigées sur des temps de réactions illimités Interchim propose :

Pour des réactions réalisées dans un ballon de volume compris entre 10ml et 2L :

• L’utilisation du réservoir Cool-It Radleys et du cryoplongeur Huber TC100E

Reservoir incassable Cool-itLe réservoir incassable Cool-it,
en HDPE, s’adapte directement
sur le plateau d’un agitateur
magnétique pour des ballons
à fond rond des volumes allant de 10ml à 250ml.
Cryoplongeur TC100ELe cryoplongeur TC100E
permet le refroidissement rapide
et contrôlé du liquide contenu
dans le réservoir Cool-It et
le maintien de sa température
(T°C max : -100°C) avec une précision de +/- 0,5k.
La combinaison de ces deux systèmes garantie la stabilité de la température du milieu du milieu et une agitation magnétique efficace sur un temps de réaction illimité.

 

Pour des réactions réalisées avec des systèmes de synthèses en parallèles :

• L’ utilisation de réservoirs dédiés aux systèmes de synthèse parallèle Radleys et du cryoplongeur Huber TC 100E

Reservoir incassable Cool CarouselLes réservoirs incassables
Cool Carousel, en HDPE,
s’adapte directement sur le plateau
d’un agitateur magnétique
pour des systèmes de synthèse parallèles 6, 12 et 24 positions.
Cryoplongeur TC100E avec Cool CarouselLe cryoplongeur TC100E
permet le refroidissement rapide
et contrôlé du liquide contenu
dans le réservoir du système
de synthèse parallèle et le maintien
de sa température (T°C max : -100°C)
avec une précision de +/- 0,5k.
La combinaison de ces systèmes garantie la stabilité de la température du milieu du milieu et une agitation magnétique efficace sur un temps de réaction illimité.

 

En savoir plus :

N’hesitez pas à nous contacter afin que nous puissions vous aider à repousser les limites de vos synthèses via la proposition de solutions adaptées.

En collaboration avec son vaste réseau de collaborateurs, Interchim® vous aidera à trouver les outils capables de répondre aux besoins de vos applications pour que votre activité soit encore plus performante et productive.

Caroussel_6_Plus_interchim_blog1218Huber_Temperature_Control_interchim_blog1218

+ d’infos

+ d’infos

+ d’infos

Pour tout renseignement complémentaire, vous pouvez contacter notre support technique au 04 70 03 73 01 ou par email à interfine@interchim.com.

Laisser un commentaire    




Guide : choisir ses marqueurs fluorescents de la surface cellulaire dans les cellules vivantes ou fixées


Logo FluoProbes

La coloration membranaire est très utile pour étudier la délimitation des cellules, la morphologie, le suivi ou la filiation des cellules, dans les études par imagerie multicolore. Les chercheurs sont toujours à la recherche de colorants appropriés à utiliser dans diverses conditions de viabilité, de fixation et de colorations expérimentales dictées par leur application.
FluoProbes® offre un large choix de colorants hautement fluorescents et photostables pour visualiser les structures cellulaires dans les expériences de marquages multicolores. Cet article présente 4 types de marqueurs les plus utiles pour colorer la surface des cellules :

① Colorants classiques :  DiO, DiI, DiA, DiD, DiB et DiR

Schema Colorants ClassiquesLes colorants carbocyanines lipophiles marquent les membranes dans une grande variété de cellules vivantes ou fixes. Procédure de coloration simple, les colorants peuvent être ajoutés directement aux milieux de culture normaux des cellules adhérentes ou en suspension. La coloration est non toxique et stable, avec très peu de transfert de colorant entre les cellules, ce qui les rend aptes au marquage cellulaire, au suivi des populations de cellules en mélange et aux études de fusion cellulaire.

Les cellules peuvent être fixées au formaldéhyde avant ou après la coloration, mais cette dernière tolère mal la perméabilisation ou la fixation au méthanol. Les colorants ne sont donc pas faciles à combiner avec la coloration intracellulaire par immunofluorescence (IF). Les colorants ne fonctionnent pas sur les bactéries ou les levures. Ils sont disponibles du bleu au proche infrarouge :

DIB, blue dye (353/442nm)FP-YS286010 mg
DIO, DIOC18(3) (484/501nm)FP-46805A50 mg
DiA (491/613nm)FP-66096A25 mg
Dil, DiIC18(3) (551/566nm)FP-46804A50 mg
DiD, DilC18(5) (644/663nm)FP-22574A50 mg
DiD, DilC18(5) oil for microinjection (644/663nm)FP-92909A25 mg
DiR, DilC18(7) (748/780nm)FP-69084A25 mg

 

Bibliographie :

BMC_Cell_Biology_interchim_blog1118Khan, J. et al., Aurora kinase-C-T191D is constitutively active mutant, BMC Cell Biology, 13:8 (2012)
 Radiation_Research_interchim_blog1118Lacoste-Collin L. et al., Effect of Continuous Irradiation with a Very Low Dose of Gamma Rays on Life Span and the Immune System in SJL Mice Prone to B-Cell Lymphoma, Radiation Research, Volume 168, Issue 6 (2007)
 BioMed_Research_International_interchim_blog1118Pacor S. et al., Effects of Two Fullerene Derivatives on Monocytes and Macrophages, BioMed Research International, 915130, 13 pages (2015)
 Protein_&_Peptide_Letters_interchim_blog1118Pelillo C. et al., Cellular Internalization and Cytotoxicity of the Antimicrobial Proline-rich Peptide Bac7(1-35) in Monocytes/Macrophages, and its Activity Against Phagocytosed Salmonella typhimurium, Protein and Peptide Letters, Volume 21, Number 4, pp. 382-390(9) (2014)
 Journal_of_Physical_Chemistry_interchim_blog1118Revillod G. et al., Multipolar Contributions to the Second Harmonic Response from Mixed DiA−SDS Molecular Aggregates, J. Phys. Chem. C, 112 (7), pp 2716–2723 (2008)
 Tianqing_Xiong_interchim_blog1118Tianqing Xiong et al., Contamination of Phenylobacterium in several human and murine cell cultures, Acta Microbiologica Sinica, 55(2): 176-186 (2015)

 

② Colorants carbocyanines plus lipophiles : Neuro-DiI, Neuro-DiO

Les colorants FluoProbes® carbocyanines sont conçus pour une diffusion plus rapide dans les membranes cellulaires. Cette propriété est particulièrement utile pour marquer les neurones dans les tissus.

Neuro-DiO, better solubility in membranes (484/501nm)FP-AM331A25 mg
Neuro-DiO in vegetable oil for microinjection (484/501nm)FP-BA641A0,2 ml
FAST DiO Solid; DiO 9,12-C18(3) (485/500nm)FP-96427A5 mg
Neuro-DiI Fast Plasma Membrane Dye (549/565nm)FP-AM330A25 mg
FAST DiI oil for microinjection; DiID9,12-C18(3),
Dilinoleyl DiI (549/565nm)
FP-87188A5 mg
FAST DiI solid; DiI 9,12-C18(3) (550/565nm)FP-12792A5 mg

 

③ Marqueurs de surface cellulaire pouvant être fixées : FP Membrane Marker FX

Ces marqueurs contiennent une amine aliphatique pour pouvoir être fixée par réaction d’un aldéhyde (formaldéhyde, glutaraldéhyde…). Cette série des FPMMarkers complète ainsi les carbocyanines lipophiles, peu compatibles avec la fixation des cellules.

FP Membrane Marker 1-43 FX (510/626nm)FP-T2982A1 mg
FP Membrane Marker 1-44 FX (480/598nm in membranes)FP-AN100A1 mg
FP Membrane Marker 2-10 FX (506/620nm)FP-AM307A1 mg

Bibliographie :

BBA_interchim_blog1118Bucki R. et al., Involvement of the Na+/H+ exchanger in membrane phosphatidylserine exposure during human platelet activation,
BBA – Molecular and Cell Biology of Lipids, 1761:2, p. 195-204 (2006)

 

④ Lectines marquées pour la coloration de la surface cellulaire : WGA et Con A

Conjugués à nos colorants FluoProbes® brillants et photostables, les lectines marquent les glycoprotéines à la surface des cellules vivantes ou fixées. La coloration à la lectine peut également résister à la fixation et à la perméabilisation. Dans les cellules pré-fixées et perméabilisées, les lectines colorent à la fois la surface cellulaire et les organites des voies sécrétoires.
Les lectines WGA et Con A sont largement utilisées pour la coloration de la surface cellulaire dans les cellules de mammifères et sont également utiles pour les colorations de bactéries Gram+ et les levures. La coloration à la lectine peut être dépendante du type de cellule.

FluoProbes® 350 – WGA (353/432nm)FP-A0IKZ05 mg
FluoProbes® 488 – WGA (494/517nm)FP-B0E9G01 mg
FluoProbes® SR101-Con A (583/603nm)FP-MT00005 mg
FluoProbes® 647H – WGA (655/676nm)FP-B0E9F01 mg

Bibliographie :

AEM_interchim_blog1118Midelet G. et al., Transfer of Microorganisms, Including Listeria monocytogenes, from Various Materials to Beef, Appl Environ Microbiol. 68(8): 4015–4024 (2002)

 

Les références et les fiches techniques des Fluoprobes® sont disponibles en ligne sur www.interchim.com.

Pour tout renseignement complémentaire, vous pouvez contacter notre support technique au 04 70 03 73 06 ou par email à interbiotech@interchim.com.

Laisser un commentaire    




6 choses à savoir pour une coloration optimale des gels d’acides nucléiques : les solutions GelRed et GelGreen


Six choses à savoir pour une coloration optimale des gels d’acides nucléiques : les solutions GelRed® et GelGreen®

Logo Biotium

Pour une alternative plus sûre au bromure d’éthidium (BET) pour vos gels d’ADN, les GelRed® et GelGreen® sont les seuls colorants de gel imperméables aux membranes cellulaires. Des tests approfondis démontrent que les colorants GelRed® et GelGreen® sont non toxiques, non mutagènes et non dangereux pour leur élimination. En outre, ils offrent une sensibilité plus élevée et un faible bruit de fond.

Schema_interchim_blog0918

L’utilisation la plus courante des colorants d’acide nucléique GelRed® et GelGreen® est dans les gels d’agarose pré-coulés, où les colorants sont ajoutés à l’agarose fondu pendant la préparation du gel.
Cet article aborde les points à garder à l’esprit pour tirer le meilleur parti de ces colorants plus performants à bien des égards, et résoudre d’éventuels problèmes apparus par méconnaissance de leurs spécificités.
Ainsi, en raison de leur plus grande taille conçue pour améliorer la sécurité, la migration des bandes d’ADN dans les gels pré-coulés peut parfois être affectée. Certains échantillons, tels que l’ADN coupé par des enzymes de restriction, peuvent migrer anormalement dans les gels pré-coulés avec le GelRed® ou le GelGreen®.

 

① GelRed® et GelGreen® sont des colorants plus gros que le BET, une caractéristique de conception liée à leur sécurité

C’est la raison pour laquelle l’ADN en trop grande quantité entraîne des bandes courbées (smears), et une migration d’ADN aberrante. La quantité de charge recommandée pour les échantillons de concentration connue ou de marqueurs de poids moléculaire d’ADN est de 50-200 ng / puits. Pour les échantillons de concentration inconnue, la charge de 1/2 à 1/4 de la quantité habituelle d’ADN résout habituellement les problèmes de migration.

Coloration de dilutions en série de ladder d’ADN 1 kb  (200 ng, 100 ng, 50 ng et 25 ng) en gel pré-coulé d’agarose 1% dans un tampon TBE. À gauche : Comparaison du GelRed® et du bromure d’éthidium (EtBr). À droite: Comparaison du GelGreen® et du Colorant Safe.

② GelRed® et GelGreen® sont des colorants ultra-sensibles, plus sensibles que le BET

Des quantités d’ADN faibles (0,1 ng ou moins) peuvent être détectées de manière fiable. Le chargement d’une quantité élevée d’ADN n’est pas nécessaire, et peut entraîner au contraire des problèmes de migration de l’ADN. Un chargement de plus faibles quantités d’ADN donne une meilleure séparation et des bandes plus nettes, économisant les échantillons précieux, les marqueurs d’ADN et diminuant ainsi les coûts.

 

③ GelRed® et GelGreen® donnent une coloration plus homogène et stable à travers le gel

Les  GelRed® et GelGreen®, plus lourds, ne migrent pas à travers le gel aussi vite que le BET. Ainsi ils évitent la perte de coloration, ou la faible coloration des bandes d’ADN de faible poids moléculaire observée avec le BET. Avec les GelRed® et GelGreen®, 1l n’est pas nécessaire d’ajouter un colorant supplémentaire au tampon d’électrophorèse.
Par ailleurs, la coloration par le GelRed est aussi plus homogène entre expériences du fait de sa meilleure stabilité que les colorants ‘Safe’.

 

④ L’utilisation d’un pourcentage de gel plus faible et une capacité tampon plus élevée peuvent améliorer la résolution de bande avec les GelRed® et GelGreen®

Comme les GelRed® et GelGreen® sont des colorants plus gros que le BET, l’ADN de haut poids moléculaire se sépare mieux sur des gels d’agarose à pourcentage inférieur.
Une résolution séparative insuffisante peut aussi être améliorée par un tampon plus fort et salin : Essayez le TBE si vous utilisez le TAE.

 

⑤ Stocker les solutions concentrées de GelRed® et GelGreen® à température ambiante.
Évitez de stocker des gels pré-coulés avec les GelRed® ou GelGreen® à 4°C.

Une faible fluorescence, une diminution de la performance du colorant au cours du temps ou un film de colorant restant sur le gel après la coloration sont des indications que les colorants peuvent avoir précipités, notamment à froid. Chauffer les solutions de colorant à ~ 50°C, et bien mélanger en vortexant.
Les gels précoulés contenant les GelRed® ou GelGreen® peuvent être stockés pendant une semaine ou un mois, respectivement, avant utilisation. Nous recommandons de conserver les gels à température ambiante (et non +4°C qui favorise la précipitation des colorants), dans l’obscurité et notamment s’ils ont été migré.

 

⑥ La post-coloration élimine toute possibilité d’interférence du colorant avec la migration de l’ADN

Avec des gros colorants à haute affinité pour les acides nucléiques comme les GelRed® et GelGreen® qui peuvent affecter la migration de l’ADN pendant l’électrophorèse, la post-coloration des gels est recommandée pour des séparations plus précises et résolutives . La post-coloration est également recommandée pour (i) une charge supérieure de la quantité recommandée d’ADN, (ii) une utilisation de tampons de charge contenant du SDS, qui peut contribuer aux bandes courbées (smears), ou (iii) un problème persistant de migration de bandes dans les gels pré-coulés avec les GelRed® ou GelGreen®. La post-coloration peut prendre de 5 à 30 minutes, selon la quantité d’ADN présente, et la solution peut être réutilisée.

Les références et les fiches techniques des  GelRed® et GelGreen® sont disponibles en ligne sur www.interchim.com.

Pour tout renseignement complémentaire, vous pouvez contacter notre support technique au 04 70 03 73 06 ou par email à interbiotech@interchim.com.

Laisser un commentaire