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Expression CMS : Analyse de compléments alimentaires avec une source ASAP / APCI


Bien que les compléments alimentaires soient soumis à des normes très strictes, il existe cependant sur le marché des produits contenant des substances interdites.

L’application ci-dessous présente l’utilisation du spectromètre de masse expression CMS Advion avec une source ASAP / APCI (source permettant une introduction directe de solide ou de liquide) pour identifier la présence de DMBA dans deux compléments alimentaires A et B. Le DMBA est une substance commercialisée aux USA et en GB sous le statut de complément alimentaire, dans des produits revendiquant des effets sur la performance sportive, la perte de poids et la stimulation cérébrale, mais qui n’a jamais été testée sur l’être humain.

Cette substance fait partie la famille du DMAA, une molécule responsable de nombreux contrôles positifs chez les sportifs et de nombreux accidents de santé.

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La technique ci-dessous démontre la capacité du spectromètre de masse expression CMS à tester rapidement la présence de DMBA ainsi que d’autres composés tels que la caféine et la vitamine B3 à partir d’une poudre, en moins de 30s par échantillon.

Un capillaire en verre est mis en contact avec la substance à analyser, il est ensuite directement introduit au niveau de la source ASAP / APCI du spectromètre de masse expression CMS pour analyse.

source_ASAP_APCI_mass2_interchim_blog_0417source_ASAP_APCI_mass3_interchim_blog_0417source_ASAP_APCI_mass4_interchim_blog_0417

Détermination du poids moléculaire à partir de standard DMBA et DMAA :

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Analyses des compléments alimentaires A et B :

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La présence de DMBA est détectée dans les deux échantillons (m/z 102.2) ainsi que de la caféine (m/z 195.2), alors que la vitamine B3 (m/z 124) est seulement présente dans l’échantillon A.

source_ASAP_APCI_mass9_interchim_blog_0417La superposition des spectres de masses indique une présence de DMBA deux fois supérieure dans le composé B que dans le composé A.

Conclusion

L’utilisation du spectromètre de masse expression CMS équipé d’une source ASAP / APCI a permis de détecter la présence de DMBA à partir d’un complément alimentaire sous forme de poudre, sans préparation d’échantillon.

En savoir plus :

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La chimie en continu, une solution permettant l’utilisation d’intermédiaires instables.


La synthèse chimique poursuit son développement grâce à l’innovation permanente de l’instrumentation. Interchim sait s’associer aux meilleurs fournisseurs du monde pour offrir à la recherche scientifique, des technologies habilitantes pour lui permettre de toujours dépasser les limites des outils actuels.

Une de ces technologies est la chimie en continue pour laquelle, Interchim collabore avec Uniqsis, un des leaders mondiaux à l’échelle meso.Flow_chemistry_Interchim_blog_031723Complémentaire aux autres techniques: batch ou micro-ondes, la chimie en continu peut aller encore plus loin dans la synthèse chimique :  l’optimisation de réactions, montée en échelle du  milligrammes jusqu’à 10 kg par jour.

Les nombreux avantages de la chimie en continu.

Réactions plus rapides.

  • Surchauffage des réactions à pression élevée permettant de réduire  le temps de synthèse. (Equation Arrhénius).
    Par exemple, certaines synthèses effectuées en batch et qui  prennent  plusieurs heures peuvent-être effectuées en quelques minutes avec la chimie en continu.

Sécurité accrue.

  • L’utilisation de petits réacteurs minimise les risques d’accidents avec des intermédiaires dangereux.

 Reproductibilité.

  • Le contrôle précis du mélange des réactifs et de la température de réaction améliorent considérable la reproductibilité ce qui est plus difficile en synthèse par batch.

Montée en échelle.

  • Aucune étape d’optimisation à faire puisque le procédé est en continu. Il peut produire de 100 g jusqu’à 10 Kg de produit par jour.

Solvants.

  • Un choix plus important  pour avoir de meilleurs : solubilités, coûts et impact sur l’environnement.

Ci-dessous, un exemple montrant l’intérêt de la chimie en continu par rapport à la chimie en batch avec l’utilisation d’intermédiaires dangereux.

La chimie en continu peut-être une solution pour travailler avec des intermédiaires instables. Un système FlowSyn™ a  permis de réaliser le réarrangement de Curtius en toute sécurité. 

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Objectif:

Le réarrangement de Curtius est une réaction utile en synthèse. Il permet de convertir des acides carboxyliques en azotures d’acyles, potentiellement explosifs, sous l’action de l’azoture de diphénylphosphoryle  pour former des isocyanates.  Ces isocyanates peuvent alors être piégés pour donner une multitude de composés.

Dans des conditions classiques, synthèse en batch, une  montée en échelle n’est pas envisageable  à cause de l’accumulation d’azoture d’acyles.

En chimie en continu, cette réaction

  • S’effectue dans un tout petit réacteur et  permet l’utilisation de faible quantité de produit.
  • Permet la transformation continu de l’azoture d’acyle et évite ainsi son accumulation.

dppa_FlowSyn_Interchim_blog_0317

Méthode:

Solvant du système : Acetonitrile.

Solution A: 4-Nitrobenzoic acid (925 mg; 5.05 mmol), triethylamine (1.40 mL; 10.0 mmol) et allyl alcohol (1.02 μL; 15.0 mmol) dans  MeCN (50 mL).

Solution B: Diphenylphosphorylazide (DPPA: 1.10 mL; 5.1 mmol) dans MeCN (50 mL).

Un  régulateur de contre-pression fixe de 100 psi est installé sur le chemin fluidique du système.

Programme utilisé, “Automated Experiment Setup”

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Le FlowSyn™ est équipé d’un programme permettant de gérer automatiquement les opérations  sans aucune surveillance, en toute sécurité et qui, en plus, inclut des phases d’arrêt et de nettoyage quand le run est terminée.

1- Le FlowSyn™ utilise  deux types réacteurs.

Le réacteur n°1 est une boucle de synthèse de 14 mL en PTFE haute température. Le contact thermique entre la bobine et le module chauffant est optimale.

2- Le réacteur n° 2 est une colonne 15 mm id x 10 cm, remplie d’un mélange de résines [1:1] Amberlyst A-21 et Amberlyst H-15. Volume de colonne : 3ml.

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3 – Un  régulateur de contre-pression fixe de 100psi  est connecté entre le tube du réacteur n°1 et la vanne de collecte.

Flow_chemistry_FlowSyn_Interchim_blog_03172

4 – Les pompes et le chemin fluidique sont amorcés.

5 – Les paramètres de synthèse sont entrés dans le menu “Auto Set Up”.

systemconf2_Flow_chemistry_FlowSyn_Interchim_blog_0317

6 – Dès que le run est lancé , le FlowSyn ™ :

  • Equilibre  automatiquement la température jusqu’à  atteinte de la consigne demandée.
  • Exécute la synthèse selon les paramètres demandés.
  • Rince le chemin fluidique du système avec le solvant.

7 – La solution collectée est évaporée pour donner 198 mg d’allyl-4-nitrophenyl carbamate sous forme d’un solide blanc, (88%).

UVLC-MS (ESI +ve): (m/z 223.1 (MH+)); Rt = 3.60 min, >99%;

IR (ATR): 3380 (s), 1730 (s),1685 (m), 1610 (m), 1600 (m), 1545 (s), 1508 (s), 1495 (s), 1320 (s), 1305 (s),1205 (s), 1110 (s), 1050 (s), 945 (s), 850 (s), 765 (s), 750 (s), cm−1.

1H NMR (d3-MeCN, 400 MHz): dH 8.28 (1H, s), 8.15 (2H, d, J = 9.2 Hz), 7.65 (2H, d, J = 9.2 Hz), 5.98 (1H, dt, J = 17.3, 10.2, 5.8 Hz), 5.40 (1H, ddt, J = 17.2, 1.6, 1.6 Hz), 5.30 (1H, ddt, J = 10.8, 1.6, 1.6 Hz), 4.65 (2H, d, J = 5.6 Hz).

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Cet exemple illustre bien que la chimie en continu est, pour le réarrangement de Curtius,  une excellente solution  pour dépasser les limites de la chimie conventionelle pour monter en échelle.  Cette synthèse se realise en toute sécurité, sans limite et permet de synthètiser autant de composés que l’on veut.

Interchim propose une large gamme de systèmes de chimie en continu innovants et accessibles à tous pour répondre à des besoins exigeants comme la  réalisation de synthèses automatisées multi-étapes de molécules complexes, comme la synthèse de chimiothèques etc…

Systèmes modulaires

Flow_chemistry_FlowSyn2_Interchim_blog_0317Systèmes intégrés

Flow_chemistry_FlowSyn_Interchim_blog_0317Système automatisé 4 voies pour gamme de température : -40°C à +260°C.

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Comparatif coût d’une purification avec une colonne PF-15SIHP vs IR-50SI


La purification par chromatographie liquide est toujours un challenge mais également un compromis entre la pureté désirée, la charge et la durée de la purification.
Pour améliorer la pureté des composés, les chimistes doivent trouver un équilibre entre la pureté, le temps de méthode et les considérations environnementales.
Ce délicat équilibre est souvent nécessaire pour la purification d’un échantillon brut en début ou en fin de synthèse.

Le concept de l’Ultra Performance Flash Purification (UPFP) permet d’augmenter le débit en réduisant le temps et le coût de la purification par échantillon avec une confiance accrue.

Ce qui différencie l’UPFP de la chromatographie Flash habituelle est la combinaison d’une technologie avancée de nos instruments puriFlash, construits pour durer et l’utilisation de petites particules de silices sphériques contenues dans nos colonnes puriFlash, qui offre un bénéfice significatif comparé aux colonnes flash traditionnelles.

Conditions :

Instruments: puriFlash® 450
Solvants: A-Cyclohexane, B-Acétate d’éthyl
Mode d’injection : injection liquide
Echantillon: 400mg de chaque Phthalate
Volume d’injection : 3,2mL
Détection UV : 254nm

purification_colonne PF-15SIHP_IR-50SI_interchim_blog_0217

Coût de la purification :

purification_colonne PF-15SIHP_IR-50SI_cout_interchim_blog_0217

  • Cyclohexane prix au litre (Prix catalogue): 25.10€
  • Acétate d’éthyl prix au litre (Prix catalogue): 18.70€
  • Main d’œuvre par heure: 75€
  • Recyclage des solvants non halogéné (Prix catalogue): 0,00035€/mL
  • Recyclage de silice (Prix catalogue): 0,0009€/mL

Conclusion

La colonne 15µSIHP-F0040 donne de meilleurs résultats avec une meilleure résolution, efficacité, capacité de charge, et de meilleurs temps de rétention comparé à une colonne IR-50SI.
Utiliser une colonne 15µSIHP réduit le temps de rétention de 45%, le temps de manipulation des fractions (évaporation etc…) de 114%,  la consommation de solvant de 59%  et réduit de 26% le cout total de la purification. Un volume de collecte plus faible a pour conséquence un temps d’évaporation moindre.

Si la sélectivité suffisante est atteinte, les colonnes 15μSIHP permettent d’obtenir une plus grande pureté de fraction.
Le meilleur rapport coût/productivité est obtenu avec des colonnes remplies de silice 15 μm.

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HPLC : zoom sur les phases stationnaires C18 AQ Interchim de l’analyse à la purification


Quelque soit le domaine d’application (pharmaceutique, environnement, agroalimentaire, cosmétique…) une question se pose pour l’analyse par HPLC ou UHPLC de composés polaires : quelle colonne choisir ?

A ce jour, il existe sur le marché pléthore de colonnes analytiques greffées C18 permettant la séparation de molécules apolaires. Que ce soit avec des silices Core Shell ou avec des silices totalement poreuses, les phases C18 traditionnelles renseignent plutôt bien cette problématique analytique. Il en est de même pour les phases stationnaires C18 AQ Interchim, qui se comportent avec les composés hydrophobes de manière similaire aux phases stationnaires C18 traditionnelles.

Qu’en est-il pour l’analyse de molécules plus polaires ?

Pour l’analyse de molécules plus polaires, plusieurs questions se posent lors d’un développement analytique :

  • Mes molécules seront-elles retenues sur une colonne C18 traditionnelle ?
  • Dois-je développer une méthode avec l’utilisation d’ajout d’un appariement d’ions dans la phase mobile ?
  • La méthode d’analyse sera-t-elle compatible avec une détection MS ?
  • Dois-je utiliser une colonne de sélectivité différente, Hilic par exemple ?

Polyvalence des phases stationnaires C18 AQ

Les phases stationnaires C18 AQ Interchim présentent un domaine d’utilisation bien plus large que les phases C18 traditionnelles.

  • Dans le pharmaceutique : pour l’analyse de principes actifs, métabolites, impuretés, excipients etc. ou l’analyse d’oligonucléotides, peptides, polypeptides etc.
  • Dans l’environnement : pour l’analyse LC/MS de multirésidus de produits phytosanitaires
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(cliquez sur l’image pour agrandir)

Avantages des phases stationnaires C18 AQ

  • Les phases stationnaires Interchim C18AQ sont stables en 100% H2O

Les greffes C18 traditionnelles ne permettent pas l’utilisation de phases mobiles contenant plus de 95% d’eau. Au-delà de cette valeur, les chaînes C18 se recroquevillent vers la surface de la silice ce qui conduit  à des pertes de rétention et de séparation des analytes.

La technologie de greffage Interchim C18 AQ garantit une colonne qui apporte une parfaite répétabilité des temps d’analyses dans des conditions de phases mobiles 100% aqueuses.

Interchim C18 AQ : stable sous 100% H2O

phases_C18AQ_stable_interchim_blog_1701

 

Phases Interchim C18 AQ

=> Parfaitement utilisable avec les phases mobiles 100% aqueuses

Répétabilité des temps d’analyses avec les phases mobiles 100% H2O

 

silice_C18_interchim_blog_1701

 

 

Silice C18

=> La greffe C18 se condense vers la surface de la silice dans des conditions >95% H2O

=> Pas ou perte de rétention & séparation

 

 

 

  • Les phases stationnaires Interchim C18 AQ sont Rétentives et Sélectives pour les composés polaires qui représentent l’essentiel des molécules à analyser et à purifier d’aujourd’hui

En phase mobile100% H2O, on observe une rétention accrue des analytes avec les phases Interchim C18 AQ.

Grâce à leur technologie d’end-capping, elles apportent des sélectivités polaires spécifiques que les phases C18 traditionnelles ne présentent pas. Elles séparent des produits très peu retenus là où des phases C18 traditionnelles échouent.

Interchim C18 AQ : rétentive avec les composés polairesphases_C18AQ_retentive_interchim_blog_1701

 

 

 

Phases Interchim C18 AQ

=> Meilleure rétention des composées polaires

 

 

 

Silice C18 classique

=> Rétention plus faible des composés polaires

 

 

 

Interchim_ColonneHPLC_C18AQvsC18-sélectivité_polaires

(Cliquez sur l’image pour l’agrandir)

  • Les phases stationnaires Interchim C18 AQ montrent une bonne symétrie de pics avec les composés basiques

L’activité de surface des silanols résiduels des phases Interchim C18 AQ est faible, ce qui conduit à une bonne symétrie de pics pour les composés basiques.

(Cliquez sur l'image pour l'agrandir)

(Cliquez sur l’image pour l’agrandir)

 

  • Les phases stationnaires Interchim C18 AQ sont disponibles de l’analytique à la purification, des Core-Shell au Préparatif

    Disponibilité des phases stationnaires C18 AQ Interchim

    Interchim_ColonneHPLC_PrepLC_Flash_C18AQ_disponibilité

    (Cliquez sur l’image pour agrandir)

Conclusion

Les phases stationnaires C18 AQ sont :

  • Polyvalentes
  • Stables avec des phases mobiles 100% aqueuses
  • Rétentives et Sélectives pour les composés polaires qui représentent l’essentiel des molécules à analyser et à purifier d’aujourd’hui
  • Elles possèdent une bonne symétrie de pics avec les composés basiques

Tous ces avantages font des phases stationnaires C18 AQ, des produits de référence dans les laboratoires d’analyses, de l’analytique à la purification, des Core-Shell au Préparatif, une offre unique sur le marché.

En savoir plus :

C18AQ_guide_interchim_blog_0117

 

Téléchargez ou consultez notre documentation détaillée sur les phases stationnaires HPLC d’Interchim C18 AQ

Accédez directement à nos gammes de produits Uptisphere :

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Identification, Quantification & Purification des Biomolécules | Stratégie de Purification


Nous vous présentions dans cet article : “Purification de protéines : la stratégie CEP” ce qu’est une purification de protéine et la stratégie à suivre pour mener à bien celle-ci.

L’intention de ce nouvel article sur l’ identification, la quantification et la purification des biomolécules est de vous présenter en détails la stratégie CEP (Capture – Enhance – Polishing).

De l’importance d’établir un planning :

planning proteine purification

Pour rappel, une purification de protéine peut être très complexe, c’est pourquoi il faut la simplifier au maximum en définissant le planning :

 

1/ Définir l’objectif

  • Cible désirée : quelle sera l’utilisation de la protéine, donc quelle doit être sa pureté ?
  • Conditions expérimentales : éviter la perte d’activité de la protéine

2 / Décrire

  • La protéine à purifier
  • Le matériel de départ (milieu dans lequel la protéine est présente)

3/ Développer les conditions analytiques

 

La Purification Multi-étapes

La stratégie CEP répond à la question : Quelles techniques de purification faut il associer pour mener à bien ma purification multi-étapes ?

Techniques qui doivent être complémentaires et qui doivent réduire le nombre de manipulation.

Pour rappel, les techniques disponibles sont :

purification_proteine_chromatographie_technique_interchim_blog_2010

Sélection & combinaison de techniques purificatives :

Quel est le chemin pour obtenir la protéine à la pureté nécessaire ?

Toutes les techniques offrent un compromis entre Résolution, Capacité & Quantité de produit récupéré. En conséquence, les supports de purification doivent être sélectionnés pour atteindre l’objectif des étapes de la purification (Capture – Enhance – Polishing).

biomolecule_strategie_CEP_interchim_blog_0117

La stratégie CEP comporte 3 étapes :

  • Capture : équilibre entre Vitesse & Capacité
  • Enhance: équilibre entre Résolution & Quantité
  • Polishing: équilibre entre Résolution & Capacité

Capturebiomolecule_strategie_CEP_interchim_blog_0117_2

Il s’agit de la purification initiale de la molécule d’intérêt à partir du matériel source clarifié. Cette “capture” assure les bases de la véritable purification réalisée lors de l’étape suivante “Enhance”.
C’est un isolement rapide et une concentration de la protéine d’intérêt

Le plus : Concentration et Stabilisation (Elimination des protéases)

Nos conseils pour l’optimisation de cette étape :

Pour augmenter la vitesse et la capacité de charge, utilisez des résines macroporeuses et hautement substituées.
Ainsi, la capture de la protéine d’intérêt est privilégiée quand les contaminants sont rejetés pendant la phase de charge et la pureté de la protéine est optimisée pendant les phases de lavage & d’élution.
Le fait de choisir des résines macroporeuses hautement substituées garantit des vitesses de purification sans pénaliser la capacité de charge dynamique de la colonne.

Les techniques à privilégier sont :

  • Echange d’ions & Chromatographie Hydrophobe pour l’industrie
  • Affinité, IMAC, Echange d’ions & Chromatographie Hydrophobe pour les laboratoires académiques

Enhance

C’est l’étape pendant laquelle la grande majorité des impuretésbiomolecule_strategie_CEP_interchim_blog_0117_3 est enlevée.

  • La résolution est mise en avant
  • L’élution se fait en gradient multi étapes ou continu
  • Les techniques séparatives les plus souvent utilisées sont l’échange d’ions et la chromatographie hydrophobe ou l’affinité
  • Pour une excellente résolution en HIC ou IEX, chargez la colonne à 20% de sa capacité totale

Nos conseils pour l’optimisation de cette étape :

Lors de cette étape et pour optimiser la sélectivité de la purification, il faut utiliser une technique séparative différente de celle utilisée lors de la 1ére étape de « capture ».
Si, pour une raison ou pour une autre, il n’est pas possible de changer de technique, modifiez la sélectivité : modification du pH si vous travaillez en IEX, de la concentration saline pour le HIC…
Enfin, l’efficacité sera grandement améliorée en utilisant des billes non poreuses de petites tailles.

Polishing

biomolecule_strategie_CEP_interchim_blog_0117_4C’est l’étape finale au cours de laquelle les dernières traces d’impuretés sont éliminées, les molécules très proches (variants de charges, agrégats entre autres) sont séparées.

Les techniques le plus souvent utilisées sont : l’exclusion, l’Echange d’ions & la Chromatographie Hydrophobe.

Si les protéines résistent à des conditions de séparation très agressives, la chromatographie par phase inverse sera utilisée.

 

Taille des billes– Résolution vs. contre pression

Dans la mesure où chaque étape a un but différent (Dégrossissage, Purification, Polissage) les résines n’auront pas les mêmes caractéristiques. En particulier, la taille des billes sera différente.

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D’étape en étape, nous allons vers plus de précision, de résolution. Celle-ci est obtenue,  entre autre, par une réduction de la taille des billes. Ainsi, pour l’étape de Capture, des billes de 45 – 100 µm sont suffisantes, alors que pour la dernière étape de polissage des billes de 10 – 20 µm sont à privilégier.


Propriétés de chaque technique de purification

 Propriétés de chaque technique de purification

Techniques à associer

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Résumé : l’approche systématique du développement d’un projet de purification

  • Consacrer du temps à la bonne définition du projet de purification : utilisation de la protéine purifiée, quantité & qualité nécessaire
  • Etudier : – à petite échelle quelles résines sont les plus appropriées à la purification
                  – à échelle intermédiaire quelles techniques et solutions sont compatibles avec la stabilité de l’échantillon
  • Etape de Capture : concentre l’échantillon et élimine les protéases. Utiliser des colonnes de grande capacité avec des résines macroporeuses
  • Etapes suivantes : changer de techniques séparative ou de sélectivité. Utiliser des colonnes plus résolutives (diminution de la taille des billes)
  • Réduire au maximum le nombre d’étapes de purification et les manipulations pour garder l’activité protéique la plus élevée possible
  • Une SEC est un bon choix dans l’étape de polissage :la molécule d’intérêt est récupérée dans son tampon de stockage
  • Avant la purification à grande échelle, optimiser la concentration et les conditions de stockage de la protéine

Dernière recommandation : pour vos purifications gardez en mémoire qu’il vous faut rester le plus simple possible et éviter des processus trop longs : la protéine d’intérêt gardera une activité maximale et vous ferez des économies.

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Bonne année !


Happynewyear2017

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ho! ho! ohhhh!


puriFlash_Xmas_interchim_blog1216

Vous attendez noël avec impatience ?
Saviez-vous qu’avez un puriFlash vous pourriez retrouver cette magie particulière chaque jour de l’année ?

Il est encore temps de choisir le ou les votre & d’allier plaisir et travail tous les jours !

N’hésitez pas à nous contacter ou à vous rapprocher de nos distributeurs.

 

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Zika : anticorps et proteines


Le moustique tigre principal vecteur de la maladie Zika

Le moustique tigre principal vecteur de la maladie Zika

Le virus Zika a été isolé en 1947 à partir d’un singe habitant la forêt Zika située en Ouganda.
En 1952, une étude sérologique a montré que ce virus infectait l’homme : 50 personnes sur 84 testées avaient développé des anticorps contre ce virus.
Zika s’est répandu progressivement à beaucoup de pays africains et asiatiques.
Depuis avril 2015, la propagation de Zika s’est brutalement accélérée.
Après être apparu au Brésil, ce virus s’est propagé à une grande partie de l’Amérique du Sud et Centrale ainsi qu’aux Caraïbes. L’accélération de sa propagation, les graves syndromes neurologiques qu’il provoque ont poussé l’OMS à déclarer Zika comme une urgence de santé publique de portée internationale.

Interchim propose une offre complète, unique sur le marché,  dédiée à l’étude de la pathologie Zika (anticorps, protéines recombinantes, kits)

Microcéphalie: les bébés victimes de cette malformation néonatale présentent une taille de tête beaucoup plus petite que celle d'autres bébés du même âge.

Microcéphalie: les bébés victimes de cette malformation néonatale présentent une taille de tête beaucoup plus petite que celle d’autres bébés du même âge.

Symptômes de l’infection du virus zika

Dans la plupart des cas, la maladie est asymptomatique seule 1 personne sur 5 montre des symptômes semblables à ceux d’une grippe à savoir fièvre, courbatures, maux de tête, et parfois une éruption cutanée.

Zika est surtout dangereux chez les bébés nés infectés par transmission de la mère à l’enfant et est à l’origine des malformations congénitales ou microcéphalie (petite tête ou développement incomplet du cerveau).
Chez l’adulte infecté, Zika est associé à des troubles neurologiques, incluant des cas du syndrome de Guillain-Barré (SGB).

 

Nature du virus Zika : Un flavivirus de la même famille que la dengue

Le virus Zika (ZIKV) est un membre de la famille des Flaviviridae, transmis par les moustiques tigre déjà infectés du genre Aedes, tels que A. aegypti et A. albopictus. Dans certains cas, le virus peut se transmettre par voie sexuelle.

VirusZika-2Zika fait partie du même groupe de virus transmettant la dengue, la fièvre jaune, l’encéphalite japonaise, et les virus du Nil occidental. Comme les autres flavivirus, le virus Zika, de forme icosaédrique est pourvu d’une enveloppe et possède un ARN génomique simple brin, de polarité positive non segmentée. Il existe deux lignées du virus Zika: la lignée africaine, et la lignée asiatique. Les études phylogénétiques indiquent que la propagation du virus dans les Amériques est plus étroitement liée à la souche asiatique.

Des vaccins efficaces existent contre le virus de la fièvre jaune, l’encéphalite japonaise, et les tiques encéphalite, mais il n’y a pas de vaccin pour le virus Zika.

 

Nature du Virus : Un génome codant pour une polyprotéine

Le virus Zika est un ARNss (25-30 nm, ~ 11kb) de polarité positive.SchemaZika-1virus Le génome du virus Zika code pour une polyprotéine qui sera clivée :

en capside (C), en précurseur de membrane (prM), en protéine de l’enveloppe (E), et en protéines non structurales (NS1-5). La protéine E couvre la majorité de la surface du virion et est impliquée dans les étapes de la réplication, incluant la liaison cellulaire à l’hôte et la fusion membranaire.
NS1, NS3, NS5 sont de grosses protéines hautement conservées tandis que les protéines NS2A, NS2B, NS4A, et NS4B sont des protéines plus petites et hydrophobes.
Comme pour les autres flavivirus, l’ensemble des anticorps dirigés contre les protéines de structure et les protéines non structurales sont détectés lors de l’infection par le virus zika. La famille des flavivirus partage 40 à 60% de la séquence virale.

Des vaccins sont disponibles contre JEV, VFJ et la dengue. Par conséquent, il est important d’exclure la présence d’anticorps Zika dus à la vaccination et / ou infection par des virus apparentés.

 

Mécanisme d’action : SEC343MUAXL, une porte d’entrée possible pour Zika

SchemaZika-2Des études récentes ont montré que la protéine AXL (du mot grec anexelekto, c’est-à-dire non contrôlée) pouvait être une cible de reconnaissance possible de ce virus.
AXL est un récepteur tyrosine-kinase qui transmet les signaux de la matrice extracellulaire vers le cytoplasme après liaison de facteurs de croissance comme la protéine GAS6 (growth-arrest-specific gene 6) vitamine K dépendante.
Gas6 (GAS6; 721-aa humain, souris 674-aa) est une protéine contenant le domaine de l’acide gamma-carboxyglutamique (Gla) supposé être impliqué dans la stimulation de la prolifération cellulaire.
Le gène AXL (?? 894-aa humaine; 1-451-aa de domaine extracellulaire) est conservé entre les espèces de vertébrés et est fortement exprimé chez l’homme dans les cellules gliales radiales, les astrocytes, les cellules endothéliales et microgliales dans le cortex en cours de développement et chez les cellules progénitrices de la rétine en développement.

Pour vos recherches, Interchim offre toute une batterie de protéines recombinantes AXL (humaines et murines), ainsi que des anticorps monoclonaux et polyclonaux anti-AXL afin de comprendre l’importance de l’association AXL avec une infection du type Zika.

 

En savoir plus :

Zika_anticorps_proteine_interchim_blog1112Consultez ou téléchargez notre brochure dédiée au virus Zika et retrouvez dans celle-ci :

  • Toutes nos protéines recombinantes des protéines Zika
  • Tous nos anticorps dirigés contre les protéines Zika
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EvoluChem™: Système de réactifs pour criblage


Qu’est ce que les kits EvoluChem™ ?

Les kits EvoluChem™ sont des kits de criblage chimique. Ils sont les outils idéaux pour la recherche des conditions de réactions chimiques. Ces kits vous permettent de tester facilement plusieurs conditions réactionnelles simultanément en utilisant des catalyseurs et réactifs pré-pesés. La majeure partie de nos kits contiennent tous les réactifs nécessaires pour optimiser les conditions réactionnelles.

Evoluchem criblage reactif

Chimie disponible
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  • Chimie de couplage croisé
  • Suzuki
  • Pd Précatalyseurs
  • Couplage amide
  • Oxydation Biomimétique
  • Glucuronidation
  • C-H Fonctionnalisation
  • Tubes à essai pré-remplis

Avantages

  • Facilite le criblage des conditions réactionnelles
  • Permet d’étudier jusqu’à 96 conditions réactionnelles simultanément
  • Sauvegarde de votre substrat en utilisant des conditions réactionnelles à faible échelle
  • Gagne du temps sur l’étape d’optimisation

Caractéristiques

  • Vials 0.3 ml sertis avec barreau aimanté
  • Bloc réactionnel spécifiquement conçu
  • Réactifs et catalyseurs pré-pesés
  • Gamme de  température de 0°C à 120°C
  • Disponibilité de matrices préconçues ou sur mesure
  • Réactifs conditionnés sous atmosphère inerte

Système de Kits et Bloc Réactionnel

  • Chaque kit est conçu pour réaliser 2 séries de conditions réactionnelles.
  • Pour l’utilisation d’un kit, nous proposons un kit de démarrage contenant un bloc réactionnel, une seringue et un dessertisseur. Ce bloc réactionnel est compatible avec tous les kits EvoluChemTM. (Brevet en Instance)
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Les Kits de couplage Suzuki-Miyaura :
Criblage rapide des catalyseurs, solvants et bases pour le couplage croisé

Aperçu du produit :

Les kits de couplage Suzuki-Miyaura sont les outils idéaux pour la recherche des conditions de réactions chimiques. Ces kits vous permettent de réaliser facilement le criblage de plusieurs réactions simultanément en utilisant des catalyseurs et réactifs prêts à l’emploi. Ce kit contient tous les réactifs constituants les conditions réactionnelles.

Protocole standard :

Solution de substrats concentrée à 0.15M avec catalyseur à 10%, 2 équivalents de base. Volume réactionnel : 100µL. Les autres conditions peuvent être investiguées en changeant la concentration de substrat, la quantité de base.

Kits disponibles :

HCK1003-01-001: Inclus 1 set de réactifs et de solvants avec 6 catalyseurs & 4 bases
HCK1003-01-002 : Inclus 1 set de réactifs et de solvants avec 8 catalyseurs & 4 bases
Le kit contient : 4 tubes à essai contenant chaque catalyseur, 4 bases en solution aqueuse à 1M et 4 solvants.
Catalyseurs disponibles : Pd(PPh3)4, Pd(dppf)2Cl2, PdOAc2/SPhos, PdOAc2/XPhos, Pd2(dba)3/SPhos, Pd2(dba)3/ XPhos, PdOAc2/CataCXium® A et Pd(Amphos)Cl2
Bases : solutions aqueuses 1M de Na2CO3, K2CO3, K3PO4 and Cs2CO3
Solvants : Dioxane, n-Butanol, DMF et acétonitrile (dégazés à l’Argon).

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Réaction Test :

La réaction test a été réalisée en utilisant 4-methoxyphenylboronic acid et 4-bromoacetophenone en tant que substrats.

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Protocole d’utilisation du kit HCK1003-01-001

Préparer le volume requis pour une solution à 0.15 mol/L de substrats combinés (de 4- methoxyphenylboronic acid  et 4-bromoacetophenone) dans le dioxane.
Utiliser une seringue propre et sèche, ajouter 100 µl de cette solution de substrats dans un des tubes à essai et mélanger avec les catalyseurs à l’aide de la seringue.
Ajouter 30 µl de la solution de base sélectionnée (2 équivalents).
Agiter les tubes à essai dans le bloc réactionnel à 80° C pendant 5 heures.
Enlever le couvercle avec le dessertisseur.
Préparer un échantillon analytique pour chaque condition réactionnelle avec 5 µl d’échantillon dilué dans 200 µl de DMSO.
Analyser les résultats des échantillons analytiques par LC/MS.

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Purification de protéines : la stratégie CEP


Purification des protéines, un procédé qui peut se révéler aussi simple que complexe

Purifier une protéine semble simple : autant pour une protéine taggée Histidine ou GST ou pour une immunoglobuline une étape d’affinité suivi d’un polishing est suffisant, autant pour les autres protéines, le procédé est beaucoup plus complexe.
Nous allons vous exposer la stratégie de purification CEP : Capture – Enhance – Polishing

Quelques points clefs sont à garder en mémoire :

  • La stabilité des protéines
  • Quelle sera l’utilisation des protéines
  • Les outils de purification
  • Les techniques séparatives
  • Les propriétés des protéines
  • Le planning de la purification

Stabilité des protéines

Avant toute purification de protéines, il est nécessaire de se rappeler qu’elles risquent de perdre tout ou partie de leur activité.
Les risques sont dus à :

  • La présence d’inhibiteurs
  • La présence d’enzymes protéolytiques
  • La perte de leur structure
  • Leur aggregation/précipitation
  • Leur perte (adsorption non-spécifiques)
  • Modifications chimiques

Pour limiter ces risques au maximum, il faut éviter :

  • Les purifications comportant de trop nombreuses étapes
  • Un stockage prolongé
  • Les phases de congélation/décongélation

Et au contraire, il faut :

  • Optimiser les conditions de purification
  • Travailler à des températures faibles
  • Optimiser les concentrations
  • Eliminer les protéases
  • Ajouter des agents stabilisants et des co-facteurs

A quelle application est destinée la protéine purifiée ?

En fonction de l’utilisation de la protéine, les stratégies de purifications seront différentes.

protéines purification

Outils pour les purifications préparatives

En fonction des quantités de protéines désirées, les outils de purification sont très différents.

purification-protéine-manuelles-automatisées-interchim-blog-1016

Les techniques chromatographiques à notre disposition pour les purifications protéiques

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Propriétés des protéines

Toutes ces techniques peuvent être utilisées car toutes les protéines, à des degrés divers, possèdent des zones chargées négativement, des zones chargées positivement, des zones hydrophiles, des zones hydrophobes et des zones présentant des affinités pour divers marqueurs.

propriétés proteines purification

 

Le planning

planning proteine purification

 

 1/ Définir l’objectif

  • Cible désirée
  • Conditions expérimentales

2 / Décrire

  • La protéine à purifier
  • Le matériel de départ (milieu dans lequel la protéine est présente)

3/ Développer les conditions analytiques

 

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La stratégie CEP BioWorks

La stratégie CEP : comment combiner les techniques séparatives

Il faut :

  • Associer des techniques complémentaires
  • Réduire la manipulation des échantillons.

En général 3 étapes de purification sont un maximum. Au delà, la perte de protéine cible est trop importante et le rapport pureté/coût n’est plus intéressant.

Les étapes de purification :

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etapes_CEP_protéines_purification_interchim_blog_1016

“Don´t waste clean thinking on dirty enzymes” Efraim Racker

 Keep it simple !

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Résumé de la stratégie CEP

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Dans la stratégie CEP BioWorks, le planning va permettre de définir parfaitement les conditions de la purification du matériel de départ au produit final : dans quel milieu se trouve la protéine à purifier, quelle est elle (Immunoglobuline, protéine recombinante…), qu’allons nous en faire à l’issu de la purification, quelles sont les techniques de purifications les plus pertinentes.

Les diverses étapes de développement vont permettre de valider les techniques de purification, de valider les supports de purification et enfin d’optimiser les conditions opératoires (pH, forces ioniques, températures, vitesses de travail…).

 En savoir plus :

Logo_Bio_Works_Interchim_0416Accedez directement à la gamme de produit Bio-Works sur notre site :

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