Archives mensuelles : février 2015






Guide de remplissage d’une colonne en verre SNAP® avec les résines d’exclusion de Bio-Works : WorkBeads 40 SEC, WorkBeads 40/100 SEC et WorkBeads 40/10000


snap_glass_column_interchim_blog_0215Comment procéder au remplissage d’une colonne en verre SNAP® avec les résines d’exclusion de Bio-Works :  WorkBeads 40 SEC, WorkBeads 40/100 SEC and WorkBeads 40/10000 ? 
Suivez simplement notre guide !

Préparation :

Solutions de remplissage

Nous recommandons un tampon de remplissage neutre contenant environ : NaCl 100 mM, 0,05% Tween-20. Exemple : 10 mM Na-phosphate, 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4

Il est également possible d’utiliser uniquement de l’eau.

Préparation de la suspension de gel 

Verser une quantité de billes légèrement supérieur au lit de gel désiré dans un filtre en verre n°3 posé sur un erlen à vide. Pour éliminer le tampon de stockage des billes, laver avec 4 volumes d’eau puis avec 3 volumes de tampons de remplissage. Transférer le gel (X ml) dans un flacon gradué, ajouter 1,43 volume de tampon de remplissage (X x 1,43) (suspension à 70%).

Solution de stockage

Une solution à 20% ethanol est recommandée. Tout autre conservateur peut être utilisé.

Equipement

1- Utiliser une colonne SNAP® Essential Solution. Une hauteur de lit de gel de 90-100 cm est recommandée pour les gels WorkBeads 40 SEC, 40/100 SEC et 40/1000 SEC. La dimension de la colonne est choisie en fonction du volume d’échantillon à séparer. Celui ci ne doit pas excéder 1-4% du volume de gel, sinon la résoluton est déteriorée.

2- Calculer le débit maximum dans la colonne choisie :

Fmax (du support (ml/min)) = Débit linéaire max x (diamétre colonne)² x π/4 [ml/min]

Exemple : pour une colonne de 25 mmm de diamètre interne et un debit linéaire max de 10 cm/min (pour WorkBeads 40 SEC, 40/100 SEC et 40/1000 SEC) :
Fmax = 10 cm/min x (2,5 cm)² x π/4 = 49 ml/min


NB : Vérifier que la pression résultante n’est pas supérieure à la pression maximum supportée par la colonne. Réduire le débit si c’est le cas.

3- Déterminer le debit de remplissage : celui ci doit être de 75% de Fmax
Débit de remplissage = 0,75 x Fmax

4- Regrouper et laver l’équipement necessaire au remplissage : colonne compléte, reservoir de remplissage, pompe ou système chromatographique et tampon. Le réservoir de remplissage doit être de même diamétre que la colonne et, au minimum, de même longueur.

5- Vérifier que la pompe peut donner le débit de remplissage. Ne pas oublier de bloquer la pression max du système chromatographique.

6- Marquer sur la colonne la hauteur de lit de gel désirée.

Remplissage de la colonne:

Protocole de base.
Pour un remplissage de meilleur qualité, l’optimisation des paramètres est nécessaire.

1- Remplir le système chromatographique ou la pompe avec le tampon de remplissage.

2- Verser 1-2 ml de tampon de remplissage dans la colonne. Éliminer l’air du connecteur bas de la colonne en aspirant le tampon par le tube de sortie avec une seringue. Fermer la sortie basse de la colonne en laissant environ 1 cm de solution au dessus du fritté.

3- Connecter le réservoir de remplissage

snap_glass_column_interchim_blog_02154- Homogénéiser le gel en suspension et le verser avec précautions dans le réservoir. Pour éviter la formation de bulles d’air, le réservoir doit être rempli à ras bord (le ménisque doit être au-dessus du bord supérieur de la colonne). Fermer le réservoir en prenant soin de mouiller avec de l’éthanol 20% tous les éléments en contact avec les tampons et enfin, connecter la pompe.

5- Ouvrir le bas de la colonne

6- Commencer le remplissage en appliquant le débit pré-déterminé et laisser le gel sédimenter. Le débit est appliqué jusqu’à ce que hauteur de lit de gel et pression soient constants. Ceci peut prendre 1-2 heures en fonction des dimensions de la colonne. Marquer la hauteur de lit de gel quand celle ci est constante.

7- Arrêter le flux. Enlever le réservoir.

NB : le gel peut se décompresser quand le flux est stoppé.

8- Si la hauteur de lit est trop grande, enlever l’excès de résine avec précaution en re-suspendant le gel par le haut et en pipetant l’excès.

9- Remplir la colonne à ras bord avec le tampon de remplissage bord (le ménisque doit être au-dessus du bord supérieur de la colonne), mettre en place le connecteur.

10- Remettre le flux, quand la hauteur de lit de gel est constant, arrêter le flux et fermer le bas de la colonne très rapidement. Descendre le piston et l’ajuster 2-5 mm plus bas que la hauteur de lit marquée précédemment.

11- Laver la colonne avec 2 volumes de colonnes d’eau.

12- Mesurer l’efficacité et l’asymétrie de la colonne en utilisant 1 ml de tampon eau/acétone 1-4% à un débit de 1-2 cm/min :

Calcul du nombre de plateaux théorique (N):

N = 5.54 × (T1/W1/2)
T1: temps de rétention – W1/2 : largeur du pic à mi-hauteur
HETP = L/N
L : longueur de la colonne (mm)
Calcul de la symétrie de pic (S):
S = W1/2r/W1/2l
W1/2,r : Largeur du pic à mi-hauteur à la droite de la médiane du pic
W1/2,l : Largeur du pic à mi-hauteur à la gauche de la médiane du pic

Ces données (N et S) sont à mesurer régulièrement pour s’assurer que la colonne est toujours opérationnelle.

13- Mettre en œuvre la colonne ou bien pour la stocker, l’équilibrer avec un tampon Éthanol/eau 20% à un débit inférieur à 4 cm/min.

Sécurité

Reportez-vous à la fiche MSDS des WorkBeads SEC ainsi que les instructions de tous les équipements utilisés.

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En savoir plus :





Comment bien choisir son dosage protéique, un choix pas si anodin !


Le choix d’un dosage protéique : Comparaison des 2 méthodes majeures, Coomassie et BCA

 
Le choix d’un dosage protéique au laboratoire, et plus particulièrement en R&D, se ramène le plus souvent à 2 types de test colorimétrique :

  • Les méthodes qui utilisent un colorant que se fixe sur les protéines en changeant de couleur, dont la tête-de-file typique est la méthode au bleu de Coomassie développée par Bradford (1951)
  • Les méthodes mettant en œuvre la réduction de l’ion Cu(II) par les liaisons peptidiques des protéines, dont la tête-de-file est la méthode à l’acide bicinchoninique, plus connue sous l’acronyme BCA (Paul Smith, 1985).

Cet article rappelle les avantages respectifs de ces 2 méthodes majeures, Coomassie et BCA, qui présentent généralement les meilleures performances globales (sensibilité de détection et gamme d’utilisation, compatibilité avec les substances non protéiques dans l’échantillon, praticité et coût,…) pour la plupart des applications.

Adopter l’une ou l’autre méthode sur des critères d’habitude ou disponibilité au laboratoire, mène à en méconnaitre les inconvénients (notamment pour le Coomassie), l’intérêt à adapter la mise en oeuvre, ou enfin les avantages propres aux autres méthodes, apparentées ou non, pour des applications qu’elles soient de routine ou plus spécifiques.

Critères et choix de première intention

Le tableau suivant résume les critères ou caractéristiques majeures et les indications principales pour les 2 méthodes :

Coomassie_BCA_interchim_blog_0215

[A] Praticité

Le dosage de protéines au Coomassie est réputé très rapide et simple (« 1min à TA »), mais en contrepartie de cet avantage, on peut constater une variabilité des résultats.
Par exemple, il est moins reproductible pour diverses raisons, liées à sa composition colloïdale et à son apparente flexibilité en temps d’incubation .

La méthode BCA est, elle, vue comme moins pratique à mettre en œuvre (2 réactifs, incubation à température contrôlée et plus longue).
La notice technique 40840n précise ces limitations éventuelles et explique comment elles peuvent parfois être réduites voire mises à profit: BCA incubé à température ambiante ou en temps réduit; sensibilité accrue.

In fine, le BCA présente une reproductibilité entre analyses 2 fois inférieure au Coomassie (CV 10-15% contre 30%).

Coomassie_BCA_interchim_blog_0215

[Fig.1 ] Courbe standard (BSA) du dosage au Coomassie/Bradford (en haut), et du dosage par le BCA (en bas).

Contrairement au dosage BCA très linéaire (R>0.995), la courbe d’un standard en dosage Coomassie, notamment avec une régression linéaire (orange) produit une imprécision de la détermination de la concentration protéique à partir de l’absorbance d’un échantillon (marron). 
Ceci vaut aussi avec un protocole ajusté/gamme de concentration moins large.

[B] Sensibilité et gamme dynamique

La faible linéarité propre au dosage des protéines par le Coomassie (fig.1), très souvent mésestimée, retentit sur la précision des résultats. Elle oblige d’ailleurs à recourir à plusieurs protocoles, en faisant varier le ratio échantillon/réactif, voire à plusieurs réactifs.
La méthode de calcul du résultat importe grandement (une régression courbe étant à privilégier).
Il reste que la comparaison des résultats d’analyse de différentes dilutions d’un même échantillon fait apparaître souvent la limite de précision du dosage (résultats assez différents menant à privilégier une dilution donnant une valeur en milieu de gamme standard). 

Le BCA limite ces soucis en offrant une gamme de détection dynamique plus large, avec surtout un signal bien plus linéaire (proportionnel à la concentration): un seul protocole donne une excellente linéarité de 0.5 à 200µg/ml (réactif UP75860A – contre 0.5-20 en Coomassie) ou 20-1500mg/ml (réactif UP40840A – contre 20-250 ou 100-1000). 

Les résultats peuvent ainsi être exploités par simple régression linéaire (ou régression courbe, ou manuellement), et pour des échantillons très variables, lors d’une même analyse selon le même protocole, sur la même courbe standard. 
Pour plus d’informations, vous pouvez consulter la notice technique 40840n.

[c]Variations « P à P »

 Le dosage par le colorant Coomassie, comme l’amido black ou le ponceau, opère par une fixation de nature ionique et hydrophobe du colorant sur les protéines, qui modifie sa couleur. La détection dépend dont intrinsèquement de la nature de la (des) protéine(s) à doser par rapport à celle servant de standard. Les protéines riches ou pauvres en Arginine (mais aussi His, Lys et aa aromatiques) seront alors sur- ou sous-estimées. On peut ainsi mesurer 30-40% de différence, et même, par rapport à la BSA, 50% pour l’ovalbumine et jusqu’à 60% pour un inhibiteur Trypsique. 

Le dosage au BCA produit une première coloration représentative de toutes les protéines, par réaction chimique colorée du Biuret, sur les liaisons peptidiques des protéines. Même si le renforcement de la coloration du complexe reste affecté par la nature des aminoacides (la cysteine ou cystine, tyrosine, et tryptophane y participent), le BCA présente bien moins de variabilité du signal selon les protéines que le Coomassie, et 3 à 4 fois moins que le Lowry, outre qu’il est plus sensible (couleur plus intense, plus soluble). C’est essentiel pour la précision du dosage par rapport à un standard, et pour la fiabilité de mesure des protéines hétérogènes ou particulières comme des protéines membranaires, ou des mélanges complexes (extraits cellulaires). Le BCA permet même de doser des peptides que le Coomassie ne peut pas du tout détecter, avec une sensibilité cependant réduite. Le BCA dose enfin bien mieux les protéines immobilisées sur un support.  
Pour plus d’informations, vous pouvez consulter la notice technique 40840n. 

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[Fig.2]: Principe chimique du dosage des protéines par le Coomassie (fixation)[à gauche*] et par le BCA (reaction chimique) [à droite]. *:Source: in Protocol Exchange (2009), doi:10.1038/nprot.2009.214

[D] Compatibilités / interférences

Le dosage au Coomassie est sensible à divers composés apolaires et ioniques, détergents et dénaturants, les ac.nucléiques et les lipides.
Le BCA est lui sensible, dans sa version de base, à la plupart des chélatants du Cuivre et réducteurs, ce qui peut d’ailleurs être mis a profit pour doser par exemple des sucres réducteurs.

Les autres méthodes ne résolvent pas mieux (et même moins bien) l’équation entre sensibilité de détection, spécificité des protéines, tolérance, praticité et coût.

Pour les échantillons contenant notamment à la fois des détergents et des réducteurs à forte concentration, sans sacrifier la performance en sensibilité et spécificité de détection, il faut combiner des stratégies neutralisant ou éliminant les interférents. 

Il est conseillé de :

– sélectionner la méthode de dosage présentant la meilleure compatibilité avec les composés non protéiques de l’échantillon, à commencer par celles du BCA (tableau) ou si besoin du Coomassie (tableau).

-si des composés interférent, les éliminer: la méthode PPR est probablement la solution la plus simple, rapide, flexible et efficace (applicable à quasi tous les interférents avec un bon rendement). 

Le PPR, en <10minutes, résout les interférences les plus gênantes au laboratoire, comme les aa Tyrosine, cysteine, tryptophane, glycine, mais aussi l’imidazole, le Tris, les réducteurs DTT, bME, le sulfate d’ammonium, les tanins d’extraits végétaux….

En savoir plus :

  • Plus d’informations sur les sujets suivants sont disponibles sur demande, n’hésitez pas à nous contacter

– les produits BC Assay # UP40840A, le CooAssay #UPF86400 et leur version « No-Interference » incluant le réactif PPR #R5594A, et sur son applicabilité à votre application particulière,
– les autres méthodes de dosage protéiques disponibles: avec lecture à d’autres couleurs (450, 660nm, 750nm), à signal fini, plus adaptées pour les micro-échantillons, la récupération des protéines après dosage, le dosage de peptides et leur clivage ou digestion, et les dosages de protéines par fluorescence (plus sensibles). 





Regroupez vos anticorps chez Interchim – l’infographie !


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credit photo : Freepik





Pourquoi préferer la Silice sphérique à la Silice irrégulière pour optimiser vos purifications par chromatographie liquide?


La purification par chromatographie liquide est toujours un défi et il y a souvent un compromis à trouver entre la pureté obtenue, le chargement de l’échantillon, et le débit souhaité.
Pour améliorer l’efficacité dans l’obtention de composés purs, les chimistes doivent trouver le meilleur équilibre entre la pureté, la durée de la méthode, et les considérations environnementales. Cet équilibre délicat est souvent nécessaire aussi bien pour des produits bruts que pour une purification finale.

Le Concept UPFP, Ultra Performance Flash Purification, permet de travailler avec un débit plus élevé, donc de réduire le temps et le coût par échantillon, le tout avec une efficacité plus grande.

Ce qui différencie ce concept UPFP de la chromatographie Flash traditionnelle, est la combinaison d’une technologie de machine performante, et de la maîtrise de petites particules de silice sphérique dans nos colonnes de puriFlash®.flash_chromatographie_colonne_interchim_blog_0214
Cette combinaison offre des avantages significatifs par rapport à la silice traditionnelle de qualité flash.

La colonne puriFlash : L’outil de séparation

sélectivité_capa_productivité_interchim_blog_0215La sélection du support doit tenir compte du volume de l’échantillon, de la nature de l’analyte et de sa concentration, et des propriétés intrinsèques de la matière de l’absorbant.

Silice et silice greffée sont des supports rigides qui ne rétrécissent ni ne gonflent avec les solvants.

La surface de la silice peut être facilement modifiée, ce qui crée un potentiel pour une grande sélectivité pour la purification d’interactions hydrophobes-hydrophiles. La stabilité au pH de la silice greffée est limitée, typiquement dans la plage de 2 à 7,5, cela dépend de la chimie. Plus de 20 silices différentes en sélectivité sont disponibles pour satisfaire à tout type de purification.
Grâce à notre silice sphérique ultra-pure, nous pouvons obtenir une plus grande reproductibilité, et ainsi réaliser des purifications d’échantillons optimisées.

Quels bénéfices pouvons-nous tirer des silices de plus fine granulométrie ?

Nous avons comparé la purification de deux colorants alimentaires sur une colonne standard et une colonne puriFlash.

1. Première purification : Avec silice irrégulière 50 µm – colonne de 12g (Réf: IR-50SI / 12g).
Deux éléments importants peuvent être observés sur les images:

  • Peu d’espace entre les composés jaune et bleu, ce qui signifie une capacité de chargement faible.
  • Les 2 colorants présentent une large bande, ce qui implique un grand volume de collecte. 

silice_irregular_interchim_blog_02152. Deuxième purification : Avec silice sphérique 15 µm – 12 g (Réf: PF-15SIHP / 12g) en utilisant les mêmes conditions.
On constate d’énormes différences par rapport à la purification précédente :

  • Sur l’image 3, nous constatons que lorsque le jaune sort de la colonne, le bleu n’a pas commencé à descendre, ce qui signifie que nous avons la totalité de la longueur du lit disponible, et que l’on peut donc accepter plus de produits. La capacité en est considérablement améliorée.
  • Sur l’image 4, la zone du composé bleu est très petite, présentant une couleur bleu foncé. Le produit est donc très concentré, ce qui induit un petit volume de collecte et donc un temps réduit pour l’évaporation.

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3. Troisième purification : Optimisation des conditions de gradient.

Nous avons réalisé la même purification, en optimisant le gradient, avec pour objectif un temps de purification réduit tout en gardant une résolution satisfaisante.

Nous avons réalisé la même purification, en optimisant le gradient, avec pour objectif un temps de purification réduit tout en gardant une résolution satisfaisante.

CONCLUSION :

Comme vous pourrez le constater, l’utilisation de fines particules sphériques améliore grandement la purification : 

  • Meilleure résolution
  • Chargement de l’échantillon plus important
  • Réduction de la durée de la purification
  • Volumes de collecte moins importants
  • Temps d’évaporation réduit

En savoir plus : 





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