Archives quotidiennes : 22 janvier 2016






TSKgel® UP-SW3000, du nouveau dans les colonnes UHPLC de Tosoh


tosoh_interchim_blog_0116Les colonnes TSKgel UP-SW3000 pour les séparations par exclusion de taille (SEC) remplies avec des billes sur base silice de 2 µm sont la dernière génération des très populaires colonnes TSKgel les standards les plus élevées pour l’analyse des anticorps thérapeutiques.

Ces nouvelles colonnes UHPLC sont développées à partir de la technologie de surface propriétaire et éprouvée des colonnes TSK renommées. Elles facilitent le transfert des méthodes HPLC vers l’UHPLC.

Principes de séparation

La chromatographie par exclusion de taille en tampon aqueux (SEC) est la méthode de choix pour l’analyse des fragments protéiques, des monoméres et aggrégats en conditions natives. Le principe de la chromatographie SEC repose sur la séparation des molécules en fonction de leur taille ou plus exactement de leur volume hydrodynamique quand elles traversent un réseau poreux. Il n’y a aucune interaction entre les molécules et la phase stationnaire.

La chromatographie par exclusion de taille en conditions aqueuses est également appelée Gel Filtration Chromatographie (GFC).

Les colonnes TSK Gel G3000SWxl sont les standards depuis de nombreuses années pour le contrôle qualité des anticorps monoclonaux.

Caractéristiques

  • Qualité éprouvée des colonnes TSKgel SW
  • Absence d’interactions non spécifiques
  • Transfert aisé des méthodes HPLC classiques
  • Optimisées pour le contrôle qualité des anticorps monoclonaux (mAb)
  • Ces nouvelles colonnes sont utilisables aussi bien en HPLC qu’en UHPLC et sont disponibles en 15 et 30 cm de long.
  • Les colonnes de 15 cm permettent des analyses rapides, celles de 30 cm apportent une grande résolution dans l’analyse de mAb. La durée de vie des colonnes peut être grandement améliorée en utilisant les colonnes de gardes correspondantes. Ces dernières sont directement connectées sur les colonnes analytiques ce qui réduit au maximum les volumes morts.
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Figure 1 Comparaison des courbes de calibration

Colonnes :
A : TSKgel UP-SW3000 (300 x 4,6 mm, rouge)
B : TSKgel Super SW3000 (300 x 4,6 mm, bleue)
C : TSKgel G3000SWxl (300 x 7,8 mm, gris)

Phase mobile :
100 mmol/L tampon phosphate (pH 6,7) + 100 mmol/L sulfate de sodium + 0,05% NaN3
Débit : A&B : 0.35 mL/min ; C : 1 mL/min
Température : 25°C ;
Détection : UV 280 nm

Echantillons :
Thyroglobuline (640000 Da)
G-Globuline (155000Da)
Ovalbumine (47000 Da)
Ribonuclease A (13700 Da)
P-aminobenzoïque acide (137 Da)

 

 

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Figure 2 Comparaison des colonnes SW A : TSKgel UP-SW3000 2 µm 45.625 0.95 B : TSKgel SuperSW3000 4 µm 24.419 1.02 C : TSKgel G3000SWxl 5 µm 18.325 1.05 Colonnes : A : TSKgel UP-SW3000 (300 x 4,6 mm, rouge) B : TSKgel Super SW3000 (300 x 4,6 mm, bleue) C : TSKgel G3000SWxl (300 x 7,8 mm, gris) Phase mobile : 100 mmol/L tampon phosphate (pH 6,7) + 100 mmol/L sulfate de sodium + 0,05% NaN3 Débit : A&B : 0.35 mL/min ; C : 1 mL/min Température : 25°C ; détection : UV 280 nm Echantillons 1. Thyroglobuline (640000 Da) 2. G-Globuline (155000Da) 3. Ovalbumine (47000 Da) 4. 4. Ribonuclease A (13700 Da) 5. P-aminobenzoïque acide (137 Da)

Colonnes :
A : TSKgel UP-SW3000 (300 x 4,6 mm, rouge)
B : TSKgel Super SW3000 (300 x 4,6 mm, bleue) C : TSKgel G3000SWxl (300 x 7,8 mm, gris)

Phase mobile : 100 mmol/L tampon phosphate (pH 6,7) + 100 mmol/L sulfate de sodium + 0,05% NaN3
Débit : A&B : 0.35 mL/min ; C : 1 mL/min Température : 25°C ; détection : UV 280 nm

Echantillons :
Thyroglobuline (640000 Da)
G-Globuline (155000Da)
Ovalbumine (47000 Da)
Ribonuclease A (13700 Da)
P-aminobenzoïque acide (137 Da)

 

 

 

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Gamme de séparation

La figure 1 montre la courbe de calibration et la gamme de poids moléculaire du nouveau support d’analyse 2 µm TSKgel UP-SW3000 comparée aux 5 µm TSKgel G3000SWxl et 4 µm TSKgel SuperSW3000. Ces courbes sont quasiment identiques ce qui facilite les transferts de méthodes existantes.

Les nouvelles colonnes TSKgel UP-SW3000 ont les mêmes limites d’exclusions des colonnes SW conventionnelles mais avec des efficacités bien supérieures. La figure 2 montre l’augmentation de la résolution réalisée grâce aux dimensions des tailles des particules (respectivement 5, 4 et 2 µm)

Reproductibilité des performances

Les colonnes TSKgel SW sont réputées pour leurs qualités et reproductibilité. Les 40 ans d’expérience en SEC GFC ont aboutis à l’UHP-SEC. La figure 3 prouve l’excellente reproductibilité de lot-à-lot.

Application

Les TSKgel UP-SW3000 sont destinées aux séparations des diméres, monoméres et fragments d’anticorps en 1 run avec une ultra haute résolution (figure 4). Une seule colonne UP-S W3000 présente une meilleure résolution que deux colonnes G30 00SWxl en série.

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Figure 3 Reproductibilité de lot-à-lot

 

 

Colonne :
TSKgel UP-SW3000 300 x 4.6 mm de 4 lots différents

Echantillons :
Thyroglobuline (640000 Da)
G-Globuline (155000Da)
Ovalbumine (47000 Da)
Ribonuclease A (13700 Da)
P-aminobenzoïque acide (137 Da)

 

 

Hplc colonne - analyse anticorps monoclonaux Tosoh Interchim blog 0116
Figure 4 Analyses d’anticorps monoclonaux

Colonnes : A) TSKgel G3000SWXL, 5 μm, 300 x 7,8 mm x 2;
B) TSKgel UP-SW3000, 2 μm, 300 x 4,6 mm

Phase mobile : 100 mmol/L tampon phosphate (pH 6,7) + 100 mmol/L sulfate de sodium + 0,05% NaN3
Débit : A) 1.0 mL/min, B) 0.35 mL/min;
Température: 25°C
Detection: UV 280 nm;
Volume injecté.: 10 μL
Echantillon : IgG chimérique Souris-Humain, monoclonal, 1 trimére, 2 dimére, 3 monomére, 4 fragment

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