Archives quotidiennes : 29 janvier 2016






Chimies Click et marquage métabolique


Les techniques de conjugaison dites Click reposent sur l’utilisation de 2 groupes réagissant entre eux très spécifiquement, c’est-à-dire sans interférer notamment avec l’environnement biologique.
Cette caractéristique (bioorthogonalité) permet de réaliser des couplages et marquages in vivo: le marquage métabolique consiste à fournir un des groupes partenaires couplé à une ‘brique’ utilisée par la cellule pour ses synthèses, typiquement des sucres, acides aminés ou nucléotides.
L’autre groupe partenaire porté par un marqueur aisément détectable est ajouté séparément pour se fixer et ainsi réveler les composés néosynthétisés avec le premier groupe.
On peut ainsi étudier l’expression de protéines, la localisation ou redistribution, la viabilité cellulaire…

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Cet article présente les caractéristiques et avantages de la chimie click et l’illustre dans deux applications types. D’autres applications sont documentées dans la notice technique SHJENm, dont le suivi de la synthèse de DNA (avec l’EdU), de RNA (avec l’EU) et de protéines (avec l’OPP).

Les différentes applications des chimies Click

Application des chimies Click sur DNA

  • Monitoring de synthèse d’ADN (prolifération cellulaire)
  • Fonctionnalisation Click enzymatique de DNA

Application des chimies Click sur RNA

  • Monitoring de synthèse de RNA (expression de gènes et de protéines)
  • Analyse dynamique de queue poly(A) (polyadénylation)
  • Fonctionnalisation Click enzymatique de RNA

Application des chimies Click sur Protéines

  • Monitoring de synthèse de protéines (sélectif de site, de résidu)
  • Fonctionnalisation Click de protéines recombinantes
  • Purification/Pull-down de protéines fonctionnalisées Click

Application des chimies Click en analyse des Modifications Post-Translationnelles

  • Phosphorylation
  • AMPylation
  • Glycosylation
  • ADP-Ribosylation

Application des chimies Click en science des matériaux

  • Fonctionnalisation de particules, surfaces…
  • Modification des propriétés physique

Différentes chimies Click & Principe

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Avantages des chimies Click :

  • Groupes partenaires réactifs bio-inertes in-vivo : ne réagissent pas avec les biocomposés, ne gênent pas les réactions biologiques (enzymes, interactions).
  • Groupes partenaire petits: favorisent une bonne pénétration dans les cellules (préalablement perméabilisées; ou parfois non), et une bonne biodistribution entre compartiments cellulaires, dans les tissus et organismes.
  • Marquage rapide et quantitatif – faible bruit de fond – non-destructif:
    permet d’excellentes sensibilités de détection in vitro comme in-vivo, sans recourir au marquage radioactif et ses inconvénients. Permet l’analyse multiparamétrique.
  • S’applique à tout marqueur (fluo, biotine, enzyme, particule d’or, tag,…) et à de nombreuses cibles/applications: activités enzymatiques, études de binding/fixation/interactions, métabolisme…

Suivi de la synthèse in-vivo de DNA/RNA/Protéine en utilisant la chimie Click:

L’application de la chimie Click in vivo a été popularisée pour suivre la synthèse de DNA in vivo, par incorporation métabolique dans les cellules d’un nucléotides (BrdU) taggé avec un ethynyl, suivi d’une détection par un marqueur fluorescent ou autre (biotine, tag) taggé avec un azide. Similairement, elle s’applique à la synthèse des RNA et des protéines, et même de la phosphorylation ou la glycosylation.
Le tableau réunit les marqueurs biologiques utilisés (5-BrdU, 5-BrU, OPP), tandis que les marqueurs de détection qui y seront combinés, disponibles par Interchim sont:
* Marqueur fluorescent (via Azides fluorescents): pour l’imagerie par microscopie et autre analyses en fluorescence
* Tag FLAG (via FLAG-Azides): utiles pour la purification (et de la détection avec un anti-FLAG)
* Groupe Biotine (via Biotine-Azides): pour la détection par système (strept) avidine et pour la purification

Les avantages de la méthode sont:

  • Détection non-destructive et convenant à l’analyse multiparamétrique.
  • Pas de perméabilisation des cellules pour le marquage métabolique
  • Pas de dénaturation des acides nucléiques ou protéines, comme requis par les autres méthodes (avec anticorps anti 5-BrdU, WBlot de protéines,…)
  • Détection significativement plus rapide (~2 h et non 4 h+)
  • Compatible avec la cytométrie de flux & la microscopie

Cible

 

Marqueur biologique (incorporé in-vivo) et marqueur de détection (par chimie Clik).
(et marqueur ou méthode classique remplacée)

Phénomène mesuré et applications

DNA

5-Bromo-2’-deoxyuridine (5-BrdU) – Ethynyl
S’incorpore au DNA néo-synthétisé
Remplace la thymidine tritié (3H-T)

Synthèse de DNA globale de novo

Etude de la phase S du cycle cellulaire; prolifération cellulaire

RNA

5-Bromo-2’-uridine (5-BrU) – Ethynyl
S’incorpore aux RNAs naissants
Remplace l’Uracyl tritié (3H-U)

Synthèse de RNA globale de novo

mRNA

2-EA (2-Ethynyl-adenosine)
N6pA (N6-Propargyl-adenosine
Remplace les méthodes de knock-out & transfection silencing + analyse mRNAs total

Synthèses des queues   poly A de mRNA

Discrimine entre les transcrits mRNA poyadénylés nouvellement formés des préexitants

Protéine

 

 

o-Propargyl-puromycin (OPP) (cell-perméant)
S’incorpore au C-terminal des polypeptides naissants et stoppe la translation.
Remplace la 35S-methionine.
Remplace la détection différentielle des DNA et mRNA

Synthèse de Protéine globale de novo
Dynamique tant spatiale que temporelle

Ne requiert par de milieu dépourvu de methionine ni d’autoradiographie

Marquage non dépendant de la taille des protéines

Glycosides

Azide-functionalized monosaccharides :                 Ac4ManNAz, Ac4GlcNAz, Ac4GalNAz

S’incorpore aux synthèses in vivo de glycosides

Remplace les marquages radioactifs de glycanes

Etude de la glycosylation

Mesure plus spécifique des biosynthèses glyccées

Substrats de Kinases

γ-phosphate CLICK-functionalized ATP analogs:
                γ-[(Propargyl)-imido]-ATP
                γ-[(6-Azidohexyl)-imido]-ATP
                γ-[2-Azidoethyl]-ATP

Identification des substrats et etudes d’activité Kinase / Phosphorylation in vitro – sans radioactivité

AMP

N6-Propargyl-ATP (N6pATP)

AMPylation

ADP

2-Ethynyl-Adenosine-NAD+

S’incorpore aux phosphorylations endogènes
Remplace les marquages radioactifs d’analogues de nucléotides

 

Enzymatic poly ADP Ribosylation

Suivi de la synthèses des queues poly A de mRNA avec le 2-EA ou le N6pA:

Les queues Poly(A) , de longues chaines de nucléotide adenosine de longueur variable, sont ajoutées lors de la post-transcription à la terminaison 3’ des mRNA eukaryotes, par polymérase poly(A) (polyadenylation). Cette modification joue un rôle crucial dans le métabolisme des mRNA, et donc sur la régulation des gènes en influençant la stabilité des mRNA, et l’efficacité du l’export hors du noyau et la translation[1].

Les méthodes pour analyser les queues poly(A) ne permettent pas de discriminer entre les transcripts mRNA préexitants ou nouvellement poyadénylés. Les analogues d’adénosine fonctionnalisés par le groupe Alkyne, Ethynyl-adenosine (2-EA)[2] et N6-Propargyl-adenosine (N6pA) [3] sont utilisés par la synthèse de queue poly A et détectés dans les cellules mammaliennes (Fig. 4). Le 2-EA et le N6pA pénètrent dans les cellules et sont incorporés dans les nouveaux transcrits mRNA à la place de leurs analogues naturels, au niveau transcription par les RNA polymerase I, II et III, et au niveau post-transcriptionel par la poly(A) polymérase. La terminaison C des protéines est marquée par l’alkyne et détectée par chimie click: les marqueurs de détection disponibles sont:
* Marqueur fluorescent (via Azides fluorescents): pour l’imagerie par microscopie et autre analyses en fluorescence
* Tag FLAG (via FLAG-Azides): utiles pour la purification (et de la détection avec un anti-FLAG)
* Groupe Biotine (via Biotine-Azides): pour la détection par système (strept) avidine et pour la purification

Figure 4: 2-EA (2-Ethynyl-adenosine) et N6pA (N6-Propargyl-adenosine).
                Le groupe Alkyne est entouré en rouge.

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Avantages:

  • analyse sélective de transcrits mRNA nouvellement polyadénylés
  • mise en évidence très flexible(Biotine, FLAG tag et détection fluorescente)