Archives quotidiennes : 20 octobre 2016






Purification de protéines : la stratégie CEP


Purification des protéines, un procédé qui peut se révéler aussi simple que complexe

Purifier une protéine semble simple : autant pour une protéine taggée Histidine ou GST ou pour une immunoglobuline une étape d’affinité suivi d’un polishing est suffisant, autant pour les autres protéines, le procédé est beaucoup plus complexe.
Nous allons vous exposer la stratégie de purification CEP : Capture – Enhance – Polishing

Quelques points clefs sont à garder en mémoire :

  • La stabilité des protéines
  • Quelle sera l’utilisation des protéines
  • Les outils de purification
  • Les techniques séparatives
  • Les propriétés des protéines
  • Le planning de la purification

Stabilité des protéines

Avant toute purification de protéines, il est nécessaire de se rappeler qu’elles risquent de perdre tout ou partie de leur activité.
Les risques sont dus à :

  • La présence d’inhibiteurs
  • La présence d’enzymes protéolytiques
  • La perte de leur structure
  • Leur aggregation/précipitation
  • Leur perte (adsorption non-spécifiques)
  • Modifications chimiques

Pour limiter ces risques au maximum, il faut éviter :

  • Les purifications comportant de trop nombreuses étapes
  • Un stockage prolongé
  • Les phases de congélation/décongélation

Et au contraire, il faut :

  • Optimiser les conditions de purification
  • Travailler à des températures faibles
  • Optimiser les concentrations
  • Eliminer les protéases
  • Ajouter des agents stabilisants et des co-facteurs

A quelle application est destinée la protéine purifiée ?

En fonction de l’utilisation de la protéine, les stratégies de purifications seront différentes.

protéines purification

Outils pour les purifications préparatives

En fonction des quantités de protéines désirées, les outils de purification sont très différents.

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Les techniques chromatographiques à notre disposition pour les purifications protéiques

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Propriétés des protéines

Toutes ces techniques peuvent être utilisées car toutes les protéines, à des degrés divers, possèdent des zones chargées négativement, des zones chargées positivement, des zones hydrophiles, des zones hydrophobes et des zones présentant des affinités pour divers marqueurs.

propriétés proteines purification

 

Le planning

planning proteine purification

 

 1/ Définir l’objectif

  • Cible désirée
  • Conditions expérimentales

2 / Décrire

  • La protéine à purifier
  • Le matériel de départ (milieu dans lequel la protéine est présente)

3/ Développer les conditions analytiques

 

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La stratégie CEP BioWorks

La stratégie CEP : comment combiner les techniques séparatives

Il faut :

  • Associer des techniques complémentaires
  • Réduire la manipulation des échantillons.

En général 3 étapes de purification sont un maximum. Au delà, la perte de protéine cible est trop importante et le rapport pureté/coût n’est plus intéressant.

Les étapes de purification :

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“Don´t waste clean thinking on dirty enzymes” Efraim Racker

 Keep it simple !

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Résumé de la stratégie CEP

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Dans la stratégie CEP BioWorks, le planning va permettre de définir parfaitement les conditions de la purification du matériel de départ au produit final : dans quel milieu se trouve la protéine à purifier, quelle est elle (Immunoglobuline, protéine recombinante…), qu’allons nous en faire à l’issu de la purification, quelles sont les techniques de purifications les plus pertinentes.

Les diverses étapes de développement vont permettre de valider les techniques de purification, de valider les supports de purification et enfin d’optimiser les conditions opératoires (pH, forces ioniques, températures, vitesses de travail…).

 En savoir plus :

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