Archives quotidiennes : 27 janvier 2017






Identification, Quantification & Purification des Biomolécules | Stratégie de Purification


Nous vous présentions dans cet article : “Purification de protéines : la stratégie CEP” ce qu’est une purification de protéine et la stratégie à suivre pour mener à bien celle-ci.

L’intention de ce nouvel article sur l’ identification, la quantification et la purification des biomolécules est de vous présenter en détails la stratégie CEP (Capture – Enhance – Polishing).

De l’importance d’établir un planning :

planning proteine purification

Pour rappel, une purification de protéine peut être très complexe, c’est pourquoi il faut la simplifier au maximum en définissant le planning :

 

1/ Définir l’objectif

  • Cible désirée : quelle sera l’utilisation de la protéine, donc quelle doit être sa pureté ?
  • Conditions expérimentales : éviter la perte d’activité de la protéine

2 / Décrire

  • La protéine à purifier
  • Le matériel de départ (milieu dans lequel la protéine est présente)

3/ Développer les conditions analytiques

 

La Purification Multi-étapes

La stratégie CEP répond à la question : Quelles techniques de purification faut il associer pour mener à bien ma purification multi-étapes ?

Techniques qui doivent être complémentaires et qui doivent réduire le nombre de manipulation.

Pour rappel, les techniques disponibles sont :

purification_proteine_chromatographie_technique_interchim_blog_2010

Sélection & combinaison de techniques purificatives :

Quel est le chemin pour obtenir la protéine à la pureté nécessaire ?

Toutes les techniques offrent un compromis entre Résolution, Capacité & Quantité de produit récupéré. En conséquence, les supports de purification doivent être sélectionnés pour atteindre l’objectif des étapes de la purification (Capture – Enhance – Polishing).

biomolecule_strategie_CEP_interchim_blog_0117

La stratégie CEP comporte 3 étapes :

  • Capture : équilibre entre Vitesse & Capacité
  • Enhance: équilibre entre Résolution & Quantité
  • Polishing: équilibre entre Résolution & Capacité

Capturebiomolecule_strategie_CEP_interchim_blog_0117_2

Il s’agit de la purification initiale de la molécule d’intérêt à partir du matériel source clarifié. Cette “capture” assure les bases de la véritable purification réalisée lors de l’étape suivante “Enhance”.
C’est un isolement rapide et une concentration de la protéine d’intérêt

Le plus : Concentration et Stabilisation (Elimination des protéases)

Nos conseils pour l’optimisation de cette étape :

Pour augmenter la vitesse et la capacité de charge, utilisez des résines macroporeuses et hautement substituées.
Ainsi, la capture de la protéine d’intérêt est privilégiée quand les contaminants sont rejetés pendant la phase de charge et la pureté de la protéine est optimisée pendant les phases de lavage & d’élution.
Le fait de choisir des résines macroporeuses hautement substituées garantit des vitesses de purification sans pénaliser la capacité de charge dynamique de la colonne.

Les techniques à privilégier sont :

  • Echange d’ions & Chromatographie Hydrophobe pour l’industrie
  • Affinité, IMAC, Echange d’ions & Chromatographie Hydrophobe pour les laboratoires académiques

Enhance

C’est l’étape pendant laquelle la grande majorité des impuretésbiomolecule_strategie_CEP_interchim_blog_0117_3 est enlevée.

  • La résolution est mise en avant
  • L’élution se fait en gradient multi étapes ou continu
  • Les techniques séparatives les plus souvent utilisées sont l’échange d’ions et la chromatographie hydrophobe ou l’affinité
  • Pour une excellente résolution en HIC ou IEX, chargez la colonne à 20% de sa capacité totale

Nos conseils pour l’optimisation de cette étape :

Lors de cette étape et pour optimiser la sélectivité de la purification, il faut utiliser une technique séparative différente de celle utilisée lors de la 1ére étape de « capture ».
Si, pour une raison ou pour une autre, il n’est pas possible de changer de technique, modifiez la sélectivité : modification du pH si vous travaillez en IEX, de la concentration saline pour le HIC…
Enfin, l’efficacité sera grandement améliorée en utilisant des billes non poreuses de petites tailles.

Polishing

biomolecule_strategie_CEP_interchim_blog_0117_4C’est l’étape finale au cours de laquelle les dernières traces d’impuretés sont éliminées, les molécules très proches (variants de charges, agrégats entre autres) sont séparées.

Les techniques le plus souvent utilisées sont : l’exclusion, l’Echange d’ions & la Chromatographie Hydrophobe.

Si les protéines résistent à des conditions de séparation très agressives, la chromatographie par phase inverse sera utilisée.

 

Taille des billes– Résolution vs. contre pression

Dans la mesure où chaque étape a un but différent (Dégrossissage, Purification, Polissage) les résines n’auront pas les mêmes caractéristiques. En particulier, la taille des billes sera différente.

biomolecule_strategie_CEP_interchim_blog_0117_5

D’étape en étape, nous allons vers plus de précision, de résolution. Celle-ci est obtenue,  entre autre, par une réduction de la taille des billes. Ainsi, pour l’étape de Capture, des billes de 45 – 100 µm sont suffisantes, alors que pour la dernière étape de polissage des billes de 10 – 20 µm sont à privilégier.


Propriétés de chaque technique de purification

 Propriétés de chaque technique de purification

Techniques à associer

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Résumé : l’approche systématique du développement d’un projet de purification

  • Consacrer du temps à la bonne définition du projet de purification : utilisation de la protéine purifiée, quantité & qualité nécessaire
  • Etudier : – à petite échelle quelles résines sont les plus appropriées à la purification
                  – à échelle intermédiaire quelles techniques et solutions sont compatibles avec la stabilité de l’échantillon
  • Etape de Capture : concentre l’échantillon et élimine les protéases. Utiliser des colonnes de grande capacité avec des résines macroporeuses
  • Etapes suivantes : changer de techniques séparative ou de sélectivité. Utiliser des colonnes plus résolutives (diminution de la taille des billes)
  • Réduire au maximum le nombre d’étapes de purification et les manipulations pour garder l’activité protéique la plus élevée possible
  • Une SEC est un bon choix dans l’étape de polissage :la molécule d’intérêt est récupérée dans son tampon de stockage
  • Avant la purification à grande échelle, optimiser la concentration et les conditions de stockage de la protéine

Dernière recommandation : pour vos purifications gardez en mémoire qu’il vous faut rester le plus simple possible et éviter des processus trop longs : la protéine d’intérêt gardera une activité maximale et vous ferez des économies.