Archives mensuelles : mars 2019






Bénéficiez de notre service de fabrication à façon (colonnes & plaques) pour optimiser vos préparations d’échantillons SPE


A. Fabrication à façon sur demande

Nous vous proposons de fabriquer des colonnes et plaques multi-puits suivant vos spécifications.
Pour cela il suffit de nous faire parvenir une demande à :
interchrom@interchim.com
Fax : 04 70 03 82 60 – Tél. : 04 70 03 73 09

en précisant les points suivants :

  • le type d’adsorbant désiré
  • la masse d’adsorbant
  • la nature de la colonne, de la plaque ou du contenant
  • le volume de la colonne, des puits de la plaque ou du contenant
  • la nature et la porosité des frittés
  • la quantité des colonnes désirées

L’un de nos spécialistes vous contactera sous 48 heures pour valider la faisabilité du projet. Un contrat de confidentialité des données pourra être signé entre les deux parties.


Type d’adsorbant

Il peut être :

  • un adsorbant fabriqué par vos soins. Dans ce cas, il vous faut nous préciser sa nature et ses caractéristiques physiques ainsi que sa fiche de sécurité.
  • un adsorbant commercialisé et/ou fabriqué par une autre société
  • un adsorbant Interchim®

Masse d’adsorbant

Elle peut être comprise entre 15 mg et 70 g (fonction du volume de la colonne ou de la plaque choisie). La précision de nos pesées peut aller jusqu’à 1% près avec la possibilité d’obtenir un certificat de pesée pour les plaques 96 et 48 puits.

Nature de la colonne, de la plaque ou du contenant

Trois types de colonnes proposés :

  • Réservoir droit en polypropylène
  • Réservoir large capacité (LRC) en polypropylène
  • Réservoir droit en verre

3 Colonnes SPE sérigraphiées Plaques SPE Interchim

Deux types de plaques proposés :

  • Plaques 96 puits
  • Plaques 48 puits

Nous pouvons remplir tout autre type de contenant s’il est compatible avec nos systèmes de remplissage.

Volume de la colonne, de la plaque ou du contenant

  • 1 – 3 – 6 – 15 – 25 – 75 – 150 mL pour les tubes droits en polypropylène
  • 15 mL pour les réservoirs LRC en polypropylène
  • 6 mL pour les tubes droits en verre
  • 2 mL pour les plaques 96 puits en polypropylène
  • 5 ou 7 mL pour les plaques 48 puits en polypropylène

Nature et porosité des frittés

  • Polyéthylène pour les tubes droits en polypropylène et les réservoirs LRC
  • PTFE pour les tubes droits en verre
  • Polyéthylène pour les plaques 48 & 96 puits

B. Les contenants

ContenantsPhotoNatureVolumes disponiblesFrittés disponibles
Colonnes standardsSPE - Tube standardPolypropylène grade médical(1 – 3 – 6 – 15 – 25 – 75 – 150) mL20 µm Polyéthylène
Colonnes LRCSPE - Tube LRCPolypropylène grade médicalRobotic Large Capacité (LRC) 15 mL20 µm Polyéthylène
Colonnes GlassSPE - Tube verreVerre6 mL20 µm PTFE
CartouchesSPE - CartouchePolypropylène grade médicalType 300 – 600 – 900 mg20 µm Polyéthylène
Plaques 96 puitsSPE - Plaques 96 puitsPolypropylène grade médical2 mL avec des puits carrés20 µm Polyéthylène
Plaques 48 puitsSPE - Plaques 48 puitsPolypropylène grade médical5 mL avec des puits carrés20 µm Polyéthylène

 

C. La technologie Interchim® : Accurate Bed Technology™

Le procédé de fabrication Interchim® Accurate Bed TechnologyTM a été développé pour garantir une reproductibilité unique de lot à lot et de colonne à colonne.
Nos adsorbants SPE possèdent une distribution granulométrique optimisée et contrôlée de manière drastique.
Les quantités d’adsorbants sont introduites par pesée avec une précision de +/-1%.
Un certificat de pesée est délivré avec chacune de nos plaques 96 puits attestant de la masse réelle introduite dans chaque puits.
Il en résulte l’optimisation de la technique d’analyse et de l’interprétation des résultats.
Nos colonnes et plaques d’extraction SPE sont livrées dans un emballage PEHD/Al dédié au stockage longue durée.
Notre grande flexibilité et notre expérience dans le domaine du service nous permettent de satisfaire toute demande de fabrication à façon sans surcoût majeur.
Cette démarche permet d’apporter des solutions techniques nouvelles aux problématiques de nos clients et ainsi de leur faciliter le développement et l’optimisation de leur préparation d’échantillon.

Colonne SPE avec légendes

 

En savoir plus :

  • Retrouver nos consommable SPE et notre instrument, le SPE 6.25ws WorkStation sur notre site www.interchim.com
  • Consultez notre article (bientôt disponible) dédié à la méthodologie à suivre pour réussir vos préparations d’échantillons
  • Consultez notre article (bientôt disponible) dédié au développement et à l’optimisation d’une méthode SPE.
  • N’hésitez pas à nous contacter.




Développement de méthode de purification des peptides en phase inverse


 

Introduction

La chromatographie en phase inverse est une technique très utilisée pour purifier les peptides. Cette technique doit sa popularité au fait que les temps de purification sont assez courts ainsi qu’aux efficacités atteintes. Les phases mobiles utilisées (principalement acétonitrile et eau) sont volatiles, ce qui facilite les étapes de concentration/lyophilisation.

Préparation de l’échantillon – Solubilité des peptides

La solubilité des peptides en solution dépend de plusieurs paramètres :

  • la séquence en acides aminés (si des résidus hydrophobes sont présents, cela diminue la solubilité en milieu aqueux)
  • la taille et la structure tertiaire des peptides. La solubilisation change, en fonction de la répartition des résidus
  • pourcentage en résidus chargés (il faudra appliquer des pH particuliers pour aider la solubilisation).

Il existe quelques règles à connaître pour la solubilisation en milieu aqueux :

  • Les peptides constitués de moins de 5 résidus sont généralement solubles, sauf si les résidus sont hydrophobes (Tryptophane, Isoleucine, Leucine, Phénylalanine, Méthionine, Valine ou Alanine).
  • Les peptides hydrophiles contenant plus de 25% de résidus chargés (Acide glutamique, Acide asparagique, Lysine, Arginine et Histidine) et moins de 25% de résidus hydrophobes sont généralement dissous dans un milieu aqueux, à condition que les résidus chargés soient distribués dans toute la séquence
  • Les peptides hydrophobes contenant de 50% à 75% de résidus hydrophobes peuvent êtres insolubles ou partiellement solubles dans des solutions aqueuses, même s’ils contiennent 25% de résidus chargés (généralement, ils sont solubles dans le TFA et l’acide formique)
  • Les peptides acides (residus Acide glutamique et Acide asparagique) et basiques (residus Arginine, Lysine, Histidine) sont plus solubles à pH neutre qu’à pH acide.
  • Les peptides très hydrophobes qui ont plus de 75% de résidus hydrophobes ne se dissolvent pas dans des solutions aqueuses. Il est préférable de faire un dépôt solide pour convenablement injecter ces peptides.
  • Les séquences peptidiques comportant une très grande proportion en Sérine, Thréonine, Acide glutamique, Acide asparagique, Lysine, Arginine, Histidine, Asparagine, Glutamine ou Tyrosine peuvent former un réseau de liaisons hydrogènes intermoléculaires et ont une tendance à former des gels en solution aqueuse quand ils sont concentrés. Ces peptides peuvent être traités comme des peptides hydrophobes.

Bien entendu, avant de passer l’échantillon sur la colonne, il est préférable de tester la solubilité d’une petite partie dans les conditions de début de méthode. Dans le choix des solvants, préférez un solvant facilement retirable par lyophilisation pour récupérer les solutés le plus pur possible.

 

Comment sont élués les peptides ?

Les interactions qui régissent les purifications de peptides en phase inverse sont entre la phase stationnaire et le squelette hydrophobe du peptide. Elles sont non dispersives et peu sélectives avec 2 mécanismes principaux qui sont de l’adsorption et du partage.

Les petits peptides (avec des masses molaires inférieures à 3kDa) sont élués par un mécanisme de partage tandis que les peptides plus gros sont élués principalement par un mécanisme d’adsorption. Cela revient à dire que les molécules à l’injection se « collent » contre la phase stationnaire, puis éluent dès que la proportion en solvant organique atteint un pourcentage défini.

Rétention en fonction de la fraction volumique d’acétonitrile

Rétention en fonction de la fraction volumique d’acétonitrile

 

Choix de la phase stationnaire

Choix de la phase stationnaire

Le choix de phase stationnaire dépend de la longueur des chaines peptidiques des solutés qui peut limiter les interactions par gêne stérique.

On utilisera de préférence une colonne C18 pour des peptides de tailles petites et moyennes, puis une colonne C8 pour des peptides plus importants et C4 pour des polypeptides.

Le second paramètre à prendre en compte est la porosité de la phase à employer. En effet, plus le peptide sera long, plus il sera difficile de le faire passer dans un pore de petite taille. Les peptides de 1 à 5kDa se sépareront avec une taille de pore de 100Å, ceux entre 5 et 20 kDa pourront être séparés avec une taille de pore de 200Å, et les polypeptides seront utilisés avec une taille de pore de 300Å.

Le dernier point concerne la taille des particules. Etant donnée la difficulté de certaines purifications, il n’est pas intéressant d’utiliser des tailles supérieures à 30µm.

 

Choix des conditions de solvants

Les solvants les plus utilisés sont l’eau et l’acétonitrile. L’acétonitrile permet d’augmenter l’élution des peptides. Le fait que ce solvant ne réponde pas trop en UV et soit facilement retirable, en fait un choix tout indiqué.

Il est courant d’utiliser en même temps de l’acide trifluoroacétique (TFA) comme agent d’appariement d’ion (cela permet de réduire les interactions ioniques entre les peptides et la phase stationnaire). La  forte volatilité du TFA en fait un bon élément car facilement retirable (attention toutefois à ce qu’il soit présent en même proportion dans les deux solvants). Son inconvénient est qu’il rendra difficile la détection MS. Il faut alors, soit baisser sa concentration (mais on dégrade le profil), soit utiliser un autre agent comme de l’acide formique par exemple qui permet la détection.

Pour des applications avec des composés très hydrophobes, il est possible d’utiliser de l’isopropanol, solvant avec un pouvoir éluant plus important. Il présente l’avantage, non négligeable, de garder l’activé biologique des peptides. Ce solvant est principalement utilisé pour des polypeptides sur colonne C4, 300Å.

Généralement on commence la méthode avec 5% de solvant fort pour augmenter la force éluante de 1%/min, ce qui permet d’obtenir de bonnes résolutions.
Pour des applications avec des peptides polaires, il faut utiliser un mode HILIC, en démarrant avec 95% d’acétonitrile pour tendre vers 85%.

 

Influence des paramètres

Plusieurs paramètres peuvent permettre d’optimiser les purifications :

  • Gradient : Comme expliqué dans la partie mécanisme, les peptides (>3kDa) sont élués par un mécanisme d’adsorption. Un gradient par palier pour l’élution peut s’avérer utile.
  • Réactif d’appariement d’ion. Le TFA est le plus utilisé mais il est possible d’utiliser du FA, PFPA, HFBA (agent anionique) ainsi que du TEA, TBA (agent cationique) qui pourront alors aider à la séparation de peptides possédant des résidus Basiques.
  • Température : la température de la colonne est un critère d’optimisation. Il permet de diminuer la viscosité du solvant (permettant une baisse significative de la contre-pression) tout en permettant de diminuer le temps de sortie des produits. Attention toutefois à ne pas dégrader les solutés avec une température trop élevée.
  • Débit : Si pour les petites molécules, le débit est un critère d’optimisation permettant de gagner du temps avec une petite perte de résolution, c’est le contraire pour les peptides plus importants : une augmentation du débit entrainera une dégradation du profil de la purification.

Courbe de Van Deemter

Pour les peptides de faible masse molaire, il existe un débit optimal
(courbe de Van Deemter….)

Pour les peptides de masse molaire élevée, l’augmentation du débit altère le profil des pics. Cela peut même provoquer des dédoublements de pic si le débit est trop élevé.
Tyrosine : 181 g/mol
Myoglobin : 17 000 g/mol
Albumin : >60 000 g/mol

 

Troubleshooting

Si pas de rétentionRétention trop grande ou pas d’élutionSélectivité insuffisante
Vérifier le solvant de l’échantillon (la force éluante doit être inférieure ou égale à la force éluante de la phase mobile de début de run)

Vérifier la concentration en réactif d’appariement d’ions (généralement le réactif est volatil)

Vérifier le conditionnement de la colonne (éviter de laisser la colonne sous plus de 95% de solvant organique)

Diminuer la concentration de solvant organique

Diminuer la pente du gradient
Vérifier la nature et la concentration en réactif d’appariement

Augmenter la concentration en solvant organique

Augmenter la température

Changer de colonne (tester une colonne C8 ou C4 si C18 ne fonctionne pas)
Modifier le réactif d’appariement d’ion
Modifier la pente du gradient

Modifier le solvant organique (par exemple mélange acétonitrile/IPA, 90/10 max, en remplacement de l’acétonitrile seul pour les peptides très hydrophobes)

Changer de colonne (C18, phényle, C8, C4)

 

En savoir plus :





Analysez les nitrosamines dans les médicaments contre l’hypertension (retrait d’un grand nombre de lots)


1. Les nitrosamines dans le viseur des agences de médicaments

Les agences des médicaments françaises, américaines, …, ont demandé le retrait d’un grand nombre de lots de médicaments à base de Sartan, suite à la présence éventuelle d’une impureté.
N-Nitrosodimethylamine (NDMA)En effet, l’impureté incriminée est la N-Nitrosodiméthylamine (NDMA).  Cette substance est classée comme « probablement cancérogène » chez l’homme.
Les nitrosamines peuvent être générées lors de réactions chimiques utilisées pour la fabrication des inhibiteurs des récepteurs de l’Angiotensine II (Sartan).

2. L’application proposée par la FDA pour l’analyse de l’impureté N-Nitrosodiméthylamine (NDMA)

Logo FDALa FDA (Food and Drug Administration) a diffusé une application qui recommande l’utilisation d’une colonne GC polaire DB-WAX UI fabriquée par notre partenaire Agilent pour mener à bien les analyses de N-Nitrosodiméthylamine (NDMA). Pour information, cette application que vous pourrez télécharger plus bas nécessite également l’utilisation d’un passeur automatique Head Space et d’un détecteur GC/MS.

3. Présentation de la colonne GC d’Agilent recommandée et ses avantages indéniables :

Colonne Agilent DB-WAX UIA l’instar des colonnes GC de la même gamme, la colonne DB-WAX UI utilisée pour l’analyse de la molécule N-Nitrosodiméthylamine dans l’application de la FDA offre une excellente inertie avec une forme de pic plus fiable et une meilleure durée de vie que les colonnes WAX concurrentes.
 
Cette gamme de colonnes innovantes présente d’autres avantages remarquables, tels que :

•Passer moins de temps à résoudre les anomalies et à refaire les analyses :

Les colonnes GC DB-WAX UI offrent une forme de pic et une reproductibilité excellente, des limites de détection plus basses et une meilleure stabilité des temps de rétention.

•Économiser de l’argent sur les colonnes :

La durée de vie élevée de l’inertie permet une meilleure résistance à des cycles thermiques répétés.

•Arrêter de préqualifier les colonnes :

Des tests d’inertie spécifiques garantissent une performance immédiate pour toute colonne GC DB-WAX UI.

•Mettre en œuvre rapidement :

Les colonnes GC DB-WAX UI ont la même sélectivité que les colonnes GC Agilent J&W DB-WAX. Ce qui veut dire que vous pouvez facilement passer à la performance Ultra Inert sans recréer les bibliothèques de composés existantes.

Performance DB-WAX UI

Excellente inertie, même après 50 heures d’exposition à 250 °C :

Le mélange test QC DB-WAX Ultra Inert contient des composés tels que du décane, de l’acide propionique, de l’acide 2-éthylhexanoïque et de l’éthyle maltol – pour assurer une inertie constante lors de vos analyses de composés polaires les plus exigeantes.

 

En savoir plus :





Comment développer et optimiser une méthode SPE (Extraction sur Phase Solide)


Pour développer une méthode SPE robuste, reproductible et répétable, il est fondamental de choisir au mieux :

  • Le type d’adsorbant (silices ou polymères)
  • La nature de l’adsorbant
  • La masse d’adsorbant
  • Le volume du contenant

Ces quatre paramètres sont essentiels pour obtenir :

  • Une sélectivité de purification intrinsèque à l’échantillon
  • Une capacité de charge nécessaire et suffisante
  • Un facteur de pré-concentration important
  • Un rendement d’extraction optimum

Mettre en œuvre une purification SPE nécessite un minimum de connaissances sur la matrice, les impuretés, les analytes à extraire qui seront par la suite analysés. Les kits de développement de méthodes sont des outils performants et pertinents qui permettent d’apprécier rapidement le type d’adsorbant à utiliser ainsi que la sélectivité qu’il apporte pour réaliser vos extractions.
Pour plus d’informations, notre service s’engage à vous apporter le meilleur support ainsi que des solutions individualisées.

 

Protocole indicatif pour le développement de méthodes SPE sur Polymère

Protocole indicatif pour le développement de méthodes SPE sur Polymère

*Pré-traitement de l’échantillon (Soxhlet, Extraction Lig/Liq (LLE), Extraction Liquide/Solide (SLE), Filtration, Précipitation de protéines…)

Pré-traitement de l’échantillon :

Différents protocoles peuvent être nécessaires avant de déposer l’échantillon sur une colonne SPE (filtration, extraction Liquide/Liquide, extraction avec un appareillage de type Soxhlet). Ces étapes dépendent de la nature de l’échantillon (principalement solide ou liquide).


Conditionnement  :

On utilise principalement des solvants organiques de type Methanol, Acétonitrile, Dichlorométhane. Pour les échantillons aqueux, une deuxième étape de conditionnement avec de l’eau peut s’avérer nécessaire.


Dépôt de l’échantillon.

Lavage :

Le lavage élimine les composés interférents de la matrice qui auraient une légère affinité avec la phase stationnaire de la colonne SPE.

  • Un lavage légèrement acide élimine les acides faibles présents dans le milieu.
  • Un lavage légèrement basique élimine les bases faibles présentes dans le milieu.


Elution :

Les composés d’intérêt sont désorbés de la phase stationnaire.

  • Un solvant organique (Methanol, Acétonitrile, Dichlorométhane) est généralement utilisé pour l’élution des composés par ordre de polarité décroissante (ici phase inverse).
  • En échange d’ions il faut se placer à un pH correspondant à la zone dans laquelle l’analyte est sous forme neutre.

En savoir plus :