Archives quotidiennes : 6 mai 2019






Purification des protéines : Guide et éléments clés pour les réussir.


Pouvons-nous généraliser une stratégie de purification de protéines ?

Bien entendu, la purification dépend de la protéine et du contexte. Il y a donc des aspects généraux à étudier avant de mettre en place toute purification protéique.

Brièvement :

  • Le but est de trouver le chemin le plus court entre le matériel de départ et le produit final tout en ayant le meilleur rendement et garder la plus grande activité biologique
  • La pureté à obtenir est définie par l’utilisation finale du produit.

1. La pureté des protéines nécessaire est fonction des applications

La pureté des protéines est fonction des applications

Même les plus petites impuretés peuvent provoquer de grands problèmes surtout dans les applications thérapeutiques. Ces impuretés, dans les cas plus graves, peuvent être biologiquement actives. Mais, pour préserver le rendement, quand la pureté nécessaire est atteinte, c’est suffisant : il est important de différencier les impuretés devant être éliminées totalement de celles qui doivent être réduite à un niveau acceptable.

Puisque différents matériels de départ contiennent différentes impuretés, les purifications seront différentes.

La ligne fondamentale est : la qualité du produit final ne doit jamais être compromise.

 

2. Les quantités de protéines peuvent être très différentes

Les quantités de protéines peuvent être très différentes

L’échelle de la purification dépend de la quantité de protéine nécessaire mais également du volume d’échantillon et de la proportion de contaminants devant être éliminés.

La quantité de protéines purifiées peut être obtenue par de multiples cycles de purification à petite échelle si le scale-up n’est pas une option.

 

3. La finalité est l’activité biologique du produit final

3 règles :

  • Eliminer les protéases
  • Trouver les conditions qui stabilisent la protéine cible
  • Travailler rapidement

Il n’est pas toujours suffisant d’obtenir un haut degré de pureté des protéines, l’homogénéité est également très souvent importante.

Les altérations des protéines, telles que glycosylations, alkylations ou phosphorylations peuvent modifier le produit final en termes d’activité biologique et/ou de structure. Vous pouvez être amené à pratiquer d’autres purifications afin de séparer des protéines très similaires mais n’ayant pas des propriétés identiques.

Les principes basiques de purification des protéines :

De grosses colonnes ou de grandes quantités de résines de purification peuvent s’averer très onéreuses. Ainsi, il peut être intéressant de réduire les volumes à purifier dans une étape préalable à la purification proprement dite. Un des meilleurs moyens pour réaliser cela est d’utiliser une technique d’adsorption dans laquelle la protéine d’intérêt est liée à la résine et peut être éluée dans des volumes plus faibles (Echange d’ions, HIC, Affinité).

Les protéases ont une action très rapide, vous devrez donc l’être davantage. En effet, les protéases sont très souvent présentes dans les échantillons crus et doivent être éliminées très rapidement. Introduisez une étape réduisant la quantité de protéases au préalable de la purification. Vous pouvez également travailler à +4°C ou ajouter des inhibiteurs de protéases (N’oubliez pas que tout ce que vous ajoutez devra être éliminé ensuite).

Dans les premières étapes travaillez avec des techniques efficaces pour capturer la protéine d’intérêt et réduire le contenu en contaminant. Continuez avec des étapes plus sélectives pour des séparations optimales (polishing) : les granulométries des résines successives doivent être de plus en plus petites.

Combinez des étapes avec différent principes de séparation et des résines avec des sélectivités différentes pour attaquer le problème de purifications sous différents aspects.

Evitez les étapes de conditionnement en choisissant des séquences optimales : exemple HIC après IEX.

Réduisez la manutention des échantillons lors des étapes pour éviter des procédures longues qui risquent une perte d’activité ou de rendement.

 

4. Résumé des règles de base :

– Travaillez vite :

  • Eliminez les protéases pour garder active votre protéine
  • Réduisez les manutentions en choisissant une excellente combinaison de techniques

– Préparez vos échantillons pour prolonger la durée de vie de vos résines :

  • Centrifugez et filtrez vos échantillons avant leur injection dans la colonne.

– Les méthodes chromatographiques :

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