Archives de catégorie : BioChromatographie

Biomolecule Analysis & Purification

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Les supports de purification des molécules biologiques – Protéines, protéines recombinantes & les techniques de purification possibles avec l’agarose


Qu’est-ce que l’agarose ?

Il s’agit d’une chaine carbohydratée polymèrique linéaire, dont l’unité de base est le disaccharide agarobiose, extraite des algues rouges tels que Gelidium et Gracilaria.

MotifDeBaseAgarose

Algues

L’agarose fond à environ 100°C et solidifie à environ 45°C. Après refroidissement, le polymère s’agrège en une structure de fibre en double hélice.

StructureGel

FormationOfPoresInAgaroseGel

Gel d'agarose agrandi 50 000 fois

Gel d’agarose agrandi 50 000 fois

Caractéristiques de l’agarose :

  • L’ami des protéines : elles ne sont pas abimées au contact de l’agarose
  • Très grande capacité
  • Très grande sélectivité
  • Stable chimiquement (pH 1-14)
  • Facile à utiliser et présente une grande résistance mécanique
  • Très bien connue (70 – 75% des purifications des biomolécules sont réalisées avec l’agarose)

L’agarose est extrêmement hydrophile ce qui limite au maximum les liaisons non spécifiques. Son faible volume solide (4-8 %) lui confère une très importante capacité de charge. Sa structure hydrocarbonée la rend très facilement activablable, donc l’agarose est utilisable dans toutes les techniques de purification (Echange d’ions, Affinité Protéine A & IMAC, Exclusion, Hydrophobicité). Enfin, comme elle est très stable en conditions alcaline, elle peut subir les sanitisations et CIP (Cleaning In Place), qui détruisent toutes les impuretés ou protéines restantes sur le support, ce qui en fait le matériel de choix pour les purifications des protéines.

L’agarose est par nature molle, et donc pour résister à la pression engendrée lors des purifications, elle nécessite lors de sa synthèse des émulsifications et des technologies de réticulations très sophistiquée. Ceci explique le coût élevé de l’agarose comparée aux résines polymériques synthétiques. Enfin, l’agarose est un polymére naturelle ce qui implique des variations de la qualité du matériel de base (l’agarobiose).


Les techniques de purifications disponibles avec l’agarose :

L’agarose étant très facilement activable, elle peut être modifiée pour donner des supports de Chromatographie par échange d’ions (IEX – Ion Exchange Chromatography, d’affinité (IMAC- Immobilized Metal Affinity Chromatography et Protéine A), d’hydrophobicité (HIC – Hydrophobic Interaction Chromatography) et d’exclusion (SEC – Size Exclusion Chromatography).

 

IEX

SchemaFnctIEX1

Gradient de force ionique et déplacement de protéine faiblement associée à la résine

Elution progressive des protéines avec l’augmentation du gradient de force ionique

Elution progressive des protéines avec l’augmentation du gradient de force ionique

Mode de fonctionnement de l’IEX

  • Interactions électrostatiques entre une molécule chargée et un support chargé de façon opposée.
  • La charge de surface de la protéine dépend du pH

La valeur de pI de la protéine (pH auquel la charge nette de la protéine est nulle) est l’indice du pH à utiliser pour une excellente adsorption de la molécule sur le support.

 

Affinité

SchemaFnctAffinite

Mode de fonctionnement de l’Affinité

Séparation basée sur des interactions spécifiques Molécule d’intérêt/Support de purification

Il existe de nombreuses techniques de séparations pour des protéines naturelles ou recombinantes :

  • Support protéine A pour les anticorps
  • Immobilized Metal Ion Chromatography (IMAC) pour les protéines taggées Histidine
  • Support Glutathion pour les protéines taggées GST


HIC

SchemaFnctHIC

Mode de fonctionnement de l’HIC

L’échantillon protéique est dissout dans un tampon de sel de haute concentration. Les molécules d’eau près de la surface du ligand et de la surface hydrophobe de la protéine sont plus ordonnées qu’en solution (effet “protection”). Le déplacement des molécules d’eau entourant le ligand et la région H de la protéine donne lieu a une augmentation d’entropie rendant ainsi cette interaction thermodynamiquement favorisée. Interactions de type van der Waals augmentent entre le ligand et la région H avec l’augmentation de la structure ordonnée de molécule d’eau en présence de sel (“salting out”).

 

SEC

SEC

Mode de fonctionnement de la SEC

Basée sur la taille des molécules, l’ordre d’élution est inversement proportionnel au rayon hydrodynamique (taille, dimension) de la molécule. Il n’y a aucune interaction entre le support de chromatographie et les molécules à séparer.





Identification, Quantification & Purification des Biomolécules | Stratégie de Purification


Nous vous présentions dans cet article : “Purification de protéines : la stratégie CEP” ce qu’est une purification de protéine et la stratégie à suivre pour mener à bien celle-ci.

L’intention de ce nouvel article sur l’ identification, la quantification et la purification des biomolécules est de vous présenter en détails la stratégie CEP (Capture – Enhance – Polishing).

De l’importance d’établir un planning :

planning proteine purification

Pour rappel, une purification de protéine peut être très complexe, c’est pourquoi il faut la simplifier au maximum en définissant le planning :

 

1/ Définir l’objectif

  • Cible désirée : quelle sera l’utilisation de la protéine, donc quelle doit être sa pureté ?
  • Conditions expérimentales : éviter la perte d’activité de la protéine

2 / Décrire

  • La protéine à purifier
  • Le matériel de départ (milieu dans lequel la protéine est présente)

3/ Développer les conditions analytiques

 

La Purification Multi-étapes

La stratégie CEP répond à la question : Quelles techniques de purification faut il associer pour mener à bien ma purification multi-étapes ?

Techniques qui doivent être complémentaires et qui doivent réduire le nombre de manipulation.

Pour rappel, les techniques disponibles sont :

purification_proteine_chromatographie_technique_interchim_blog_2010

Sélection & combinaison de techniques purificatives :

Quel est le chemin pour obtenir la protéine à la pureté nécessaire ?

Toutes les techniques offrent un compromis entre Résolution, Capacité & Quantité de produit récupéré. En conséquence, les supports de purification doivent être sélectionnés pour atteindre l’objectif des étapes de la purification (Capture – Enhance – Polishing).

biomolecule_strategie_CEP_interchim_blog_0117

La stratégie CEP comporte 3 étapes :

  • Capture : équilibre entre Vitesse & Capacité
  • Enhance: équilibre entre Résolution & Quantité
  • Polishing: équilibre entre Résolution & Capacité

Capturebiomolecule_strategie_CEP_interchim_blog_0117_2

Il s’agit de la purification initiale de la molécule d’intérêt à partir du matériel source clarifié. Cette “capture” assure les bases de la véritable purification réalisée lors de l’étape suivante “Enhance”.
C’est un isolement rapide et une concentration de la protéine d’intérêt

Le plus : Concentration et Stabilisation (Elimination des protéases)

Nos conseils pour l’optimisation de cette étape :

Pour augmenter la vitesse et la capacité de charge, utilisez des résines macroporeuses et hautement substituées.
Ainsi, la capture de la protéine d’intérêt est privilégiée quand les contaminants sont rejetés pendant la phase de charge et la pureté de la protéine est optimisée pendant les phases de lavage & d’élution.
Le fait de choisir des résines macroporeuses hautement substituées garantit des vitesses de purification sans pénaliser la capacité de charge dynamique de la colonne.

Les techniques à privilégier sont :

  • Echange d’ions & Chromatographie Hydrophobe pour l’industrie
  • Affinité, IMAC, Echange d’ions & Chromatographie Hydrophobe pour les laboratoires académiques

Enhance

C’est l’étape pendant laquelle la grande majorité des impuretésbiomolecule_strategie_CEP_interchim_blog_0117_3 est enlevée.

  • La résolution est mise en avant
  • L’élution se fait en gradient multi étapes ou continu
  • Les techniques séparatives les plus souvent utilisées sont l’échange d’ions et la chromatographie hydrophobe ou l’affinité
  • Pour une excellente résolution en HIC ou IEX, chargez la colonne à 20% de sa capacité totale

Nos conseils pour l’optimisation de cette étape :

Lors de cette étape et pour optimiser la sélectivité de la purification, il faut utiliser une technique séparative différente de celle utilisée lors de la 1ére étape de « capture ».
Si, pour une raison ou pour une autre, il n’est pas possible de changer de technique, modifiez la sélectivité : modification du pH si vous travaillez en IEX, de la concentration saline pour le HIC…
Enfin, l’efficacité sera grandement améliorée en utilisant des billes non poreuses de petites tailles.

Polishing

biomolecule_strategie_CEP_interchim_blog_0117_4C’est l’étape finale au cours de laquelle les dernières traces d’impuretés sont éliminées, les molécules très proches (variants de charges, agrégats entre autres) sont séparées.

Les techniques le plus souvent utilisées sont : l’exclusion, l’Echange d’ions & la Chromatographie Hydrophobe.

Si les protéines résistent à des conditions de séparation très agressives, la chromatographie par phase inverse sera utilisée.

 

Taille des billes– Résolution vs. contre pression

Dans la mesure où chaque étape a un but différent (Dégrossissage, Purification, Polissage) les résines n’auront pas les mêmes caractéristiques. En particulier, la taille des billes sera différente.

biomolecule_strategie_CEP_interchim_blog_0117_5

D’étape en étape, nous allons vers plus de précision, de résolution. Celle-ci est obtenue,  entre autre, par une réduction de la taille des billes. Ainsi, pour l’étape de Capture, des billes de 45 – 100 µm sont suffisantes, alors que pour la dernière étape de polissage des billes de 10 – 20 µm sont à privilégier.


Propriétés de chaque technique de purification

 Propriétés de chaque technique de purification

Techniques à associer

technique_strategie_CEP_interchim_blog_0117_2

 

Résumé : l’approche systématique du développement d’un projet de purification

  • Consacrer du temps à la bonne définition du projet de purification : utilisation de la protéine purifiée, quantité & qualité nécessaire
  • Etudier : – à petite échelle quelles résines sont les plus appropriées à la purification
                  – à échelle intermédiaire quelles techniques et solutions sont compatibles avec la stabilité de l’échantillon
  • Etape de Capture : concentre l’échantillon et élimine les protéases. Utiliser des colonnes de grande capacité avec des résines macroporeuses
  • Etapes suivantes : changer de techniques séparative ou de sélectivité. Utiliser des colonnes plus résolutives (diminution de la taille des billes)
  • Réduire au maximum le nombre d’étapes de purification et les manipulations pour garder l’activité protéique la plus élevée possible
  • Une SEC est un bon choix dans l’étape de polissage :la molécule d’intérêt est récupérée dans son tampon de stockage
  • Avant la purification à grande échelle, optimiser la concentration et les conditions de stockage de la protéine

Dernière recommandation : pour vos purifications gardez en mémoire qu’il vous faut rester le plus simple possible et éviter des processus trop longs : la protéine d’intérêt gardera une activité maximale et vous ferez des économies.





Purification de protéines : la stratégie CEP


Purification des protéines, un procédé qui peut se révéler aussi simple que complexe

Purifier une protéine semble simple : autant pour une protéine taggée Histidine ou GST ou pour une immunoglobuline une étape d’affinité suivi d’un polishing est suffisant, autant pour les autres protéines, le procédé est beaucoup plus complexe.
Nous allons vous exposer la stratégie de purification CEP : Capture – Enhance – Polishing

Quelques points clefs sont à garder en mémoire :

  • La stabilité des protéines
  • Quelle sera l’utilisation des protéines
  • Les outils de purification
  • Les techniques séparatives
  • Les propriétés des protéines
  • Le planning de la purification

Stabilité des protéines

Avant toute purification de protéines, il est nécessaire de se rappeler qu’elles risquent de perdre tout ou partie de leur activité.
Les risques sont dus à :

  • La présence d’inhibiteurs
  • La présence d’enzymes protéolytiques
  • La perte de leur structure
  • Leur aggregation/précipitation
  • Leur perte (adsorption non-spécifiques)
  • Modifications chimiques

Pour limiter ces risques au maximum, il faut éviter :

  • Les purifications comportant de trop nombreuses étapes
  • Un stockage prolongé
  • Les phases de congélation/décongélation

Et au contraire, il faut :

  • Optimiser les conditions de purification
  • Travailler à des températures faibles
  • Optimiser les concentrations
  • Eliminer les protéases
  • Ajouter des agents stabilisants et des co-facteurs

A quelle application est destinée la protéine purifiée ?

En fonction de l’utilisation de la protéine, les stratégies de purifications seront différentes.

protéines purification

Outils pour les purifications préparatives

En fonction des quantités de protéines désirées, les outils de purification sont très différents.

purification-protéine-manuelles-automatisées-interchim-blog-1016

Les techniques chromatographiques à notre disposition pour les purifications protéiques

purification_proteine_chromatographie_technique_interchim_blog_2010

Propriétés des protéines

Toutes ces techniques peuvent être utilisées car toutes les protéines, à des degrés divers, possèdent des zones chargées négativement, des zones chargées positivement, des zones hydrophiles, des zones hydrophobes et des zones présentant des affinités pour divers marqueurs.

propriétés proteines purification

 

Le planning

planning proteine purification

 

 1/ Définir l’objectif

  • Cible désirée
  • Conditions expérimentales

2 / Décrire

  • La protéine à purifier
  • Le matériel de départ (milieu dans lequel la protéine est présente)

3/ Développer les conditions analytiques

 

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La stratégie CEP BioWorks

La stratégie CEP : comment combiner les techniques séparatives

Il faut :

  • Associer des techniques complémentaires
  • Réduire la manipulation des échantillons.

En général 3 étapes de purification sont un maximum. Au delà, la perte de protéine cible est trop importante et le rapport pureté/coût n’est plus intéressant.

Les étapes de purification :

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etapes_CEP_protéines_purification_interchim_blog_1016

“Don´t waste clean thinking on dirty enzymes” Efraim Racker

 Keep it simple !

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Résumé de la stratégie CEP

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Dans la stratégie CEP BioWorks, le planning va permettre de définir parfaitement les conditions de la purification du matériel de départ au produit final : dans quel milieu se trouve la protéine à purifier, quelle est elle (Immunoglobuline, protéine recombinante…), qu’allons nous en faire à l’issu de la purification, quelles sont les techniques de purifications les plus pertinentes.

Les diverses étapes de développement vont permettre de valider les techniques de purification, de valider les supports de purification et enfin d’optimiser les conditions opératoires (pH, forces ioniques, températures, vitesses de travail…).

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Formations : Purification par chromatographie liquide préparative et flash


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Ce cours s’adresse aux chimistes, aux chromatographistes du monde industriel et académique et plus généralement aux personnes impliquées dans les processus de synthèses et de purification des molécules issues de : l’industrie pharmaceutique, l’extraction des substances naturelles, la chimie organique, l’agro-alimentaire et la pétrochimie.

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TSKgel® UP-SW3000, du nouveau dans les colonnes UHPLC de Tosoh


tosoh_interchim_blog_0116Les colonnes TSKgel UP-SW3000 pour les séparations par exclusion de taille (SEC) remplies avec des billes sur base silice de 2 µm sont la dernière génération des très populaires colonnes TSKgel les standards les plus élevées pour l’analyse des anticorps thérapeutiques.

Ces nouvelles colonnes UHPLC sont développées à partir de la technologie de surface propriétaire et éprouvée des colonnes TSK renommées. Elles facilitent le transfert des méthodes HPLC vers l’UHPLC.

Principes de séparation

La chromatographie par exclusion de taille en tampon aqueux (SEC) est la méthode de choix pour l’analyse des fragments protéiques, des monoméres et aggrégats en conditions natives. Le principe de la chromatographie SEC repose sur la séparation des molécules en fonction de leur taille ou plus exactement de leur volume hydrodynamique quand elles traversent un réseau poreux. Il n’y a aucune interaction entre les molécules et la phase stationnaire.

La chromatographie par exclusion de taille en conditions aqueuses est également appelée Gel Filtration Chromatographie (GFC).

Les colonnes TSK Gel G3000SWxl sont les standards depuis de nombreuses années pour le contrôle qualité des anticorps monoclonaux.

Caractéristiques

  • Qualité éprouvée des colonnes TSKgel SW
  • Absence d’interactions non spécifiques
  • Transfert aisé des méthodes HPLC classiques
  • Optimisées pour le contrôle qualité des anticorps monoclonaux (mAb)
  • Ces nouvelles colonnes sont utilisables aussi bien en HPLC qu’en UHPLC et sont disponibles en 15 et 30 cm de long.
  • Les colonnes de 15 cm permettent des analyses rapides, celles de 30 cm apportent une grande résolution dans l’analyse de mAb. La durée de vie des colonnes peut être grandement améliorée en utilisant les colonnes de gardes correspondantes. Ces dernières sont directement connectées sur les colonnes analytiques ce qui réduit au maximum les volumes morts.
Hplc_colonne_Comparaison_courbes_calibration_Tosoh_Interchim_blog_0116
Figure 1 Comparaison des courbes de calibration

Colonnes :
A : TSKgel UP-SW3000 (300 x 4,6 mm, rouge)
B : TSKgel Super SW3000 (300 x 4,6 mm, bleue)
C : TSKgel G3000SWxl (300 x 7,8 mm, gris)

Phase mobile :
100 mmol/L tampon phosphate (pH 6,7) + 100 mmol/L sulfate de sodium + 0,05% NaN3
Débit : A&B : 0.35 mL/min ; C : 1 mL/min
Température : 25°C ;
Détection : UV 280 nm

Echantillons :
Thyroglobuline (640000 Da)
G-Globuline (155000Da)
Ovalbumine (47000 Da)
Ribonuclease A (13700 Da)
P-aminobenzoïque acide (137 Da)

 

 

Hplc_colonne_Comparaison_colonnes_SW_Tosoh_Interchim_blog_0116
Figure 2 Comparaison des colonnes SW A : TSKgel UP-SW3000 2 µm 45.625 0.95 B : TSKgel SuperSW3000 4 µm 24.419 1.02 C : TSKgel G3000SWxl 5 µm 18.325 1.05 Colonnes : A : TSKgel UP-SW3000 (300 x 4,6 mm, rouge) B : TSKgel Super SW3000 (300 x 4,6 mm, bleue) C : TSKgel G3000SWxl (300 x 7,8 mm, gris) Phase mobile : 100 mmol/L tampon phosphate (pH 6,7) + 100 mmol/L sulfate de sodium + 0,05% NaN3 Débit : A&B : 0.35 mL/min ; C : 1 mL/min Température : 25°C ; détection : UV 280 nm Echantillons 1. Thyroglobuline (640000 Da) 2. G-Globuline (155000Da) 3. Ovalbumine (47000 Da) 4. 4. Ribonuclease A (13700 Da) 5. P-aminobenzoïque acide (137 Da)

Colonnes :
A : TSKgel UP-SW3000 (300 x 4,6 mm, rouge)
B : TSKgel Super SW3000 (300 x 4,6 mm, bleue) C : TSKgel G3000SWxl (300 x 7,8 mm, gris)

Phase mobile : 100 mmol/L tampon phosphate (pH 6,7) + 100 mmol/L sulfate de sodium + 0,05% NaN3
Débit : A&B : 0.35 mL/min ; C : 1 mL/min Température : 25°C ; détection : UV 280 nm

Echantillons :
Thyroglobuline (640000 Da)
G-Globuline (155000Da)
Ovalbumine (47000 Da)
Ribonuclease A (13700 Da)
P-aminobenzoïque acide (137 Da)

 

 

 

Tableau_colonne_interchim_blog_0116

Gamme de séparation

La figure 1 montre la courbe de calibration et la gamme de poids moléculaire du nouveau support d’analyse 2 µm TSKgel UP-SW3000 comparée aux 5 µm TSKgel G3000SWxl et 4 µm TSKgel SuperSW3000. Ces courbes sont quasiment identiques ce qui facilite les transferts de méthodes existantes.

Les nouvelles colonnes TSKgel UP-SW3000 ont les mêmes limites d’exclusions des colonnes SW conventionnelles mais avec des efficacités bien supérieures. La figure 2 montre l’augmentation de la résolution réalisée grâce aux dimensions des tailles des particules (respectivement 5, 4 et 2 µm)

Reproductibilité des performances

Les colonnes TSKgel SW sont réputées pour leurs qualités et reproductibilité. Les 40 ans d’expérience en SEC GFC ont aboutis à l’UHP-SEC. La figure 3 prouve l’excellente reproductibilité de lot-à-lot.

Application

Les TSKgel UP-SW3000 sont destinées aux séparations des diméres, monoméres et fragments d’anticorps en 1 run avec une ultra haute résolution (figure 4). Une seule colonne UP-S W3000 présente une meilleure résolution que deux colonnes G30 00SWxl en série.

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Figure 3 Reproductibilité de lot-à-lot

 

 

Colonne :
TSKgel UP-SW3000 300 x 4.6 mm de 4 lots différents

Echantillons :
Thyroglobuline (640000 Da)
G-Globuline (155000Da)
Ovalbumine (47000 Da)
Ribonuclease A (13700 Da)
P-aminobenzoïque acide (137 Da)

 

 

Hplc colonne - analyse anticorps monoclonaux Tosoh Interchim blog 0116
Figure 4 Analyses d’anticorps monoclonaux

Colonnes : A) TSKgel G3000SWXL, 5 μm, 300 x 7,8 mm x 2;
B) TSKgel UP-SW3000, 2 μm, 300 x 4,6 mm

Phase mobile : 100 mmol/L tampon phosphate (pH 6,7) + 100 mmol/L sulfate de sodium + 0,05% NaN3
Débit : A) 1.0 mL/min, B) 0.35 mL/min;
Température: 25°C
Detection: UV 280 nm;
Volume injecté.: 10 μL
Echantillon : IgG chimérique Souris-Humain, monoclonal, 1 trimére, 2 dimére, 3 monomére, 4 fragment

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Découvrez les colonnes BABYBIO pour des Bio-purifications à baby prix !


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En savoir plus sur les :





Nouvelles colonnes HALO Glycan


Nouvelles colonnes Core-Shell dédiées aux analyses des protéines Glycan

  • 2.7 µm silice Fused-coreHalo_glycan_interchim_blog_0115
  • Ligand très polaire : groupements penta-Hydroxyles
  • Séparations des Oligosaccharides, Protéines Glycan et Glycopeptides

4 raisons de choisir les colonnes HALO Glycan :

  • La phase HALO Glycan est réalisée par le greffage d’un groupement polaire penta-Hydroxyle sur la silice fused-core de 2,7 µm. Cette nouvelle chimie de greffage nouvelle possède des propriétés exclusives.
  • La silice fused-core utilisée présente une surface spécifique de 135 m²/g et une porosité de 90 Å. Ce matériel très performant est spécifiquement dédié aux analyses et séparations des oligosaccharides et également et essentiellement aux protéines-Glycans par chromatographie HILIC (Hydrophilic Interactive LIquid Chromatography).
  • La note d’application montre la grande efficacité des colonnes HALO Glycan pour la séparation des N-Glycans.
  • Aucune autre société ne propose une gamme aussi large de particules superficiellement poreuses destinées aux bio-séparations que HALO.
Halo_glycan_interchim_blog_0115
Halo_glycan_nterchim_blog_0115

En savoir plus :

Halo_glycan_interchim_blog_0115





Chromatographie liquide : Pourquoi privilégier l’analyse HIC pour obtenir une parfaite résolution des agrégats


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La chromatographie liquide est une méthode de choix aussi bien en Recherche et Développement qu’en Contrôle Qualité en chimie, pharmacie, biotech et industrie agro-alimentaire.

Détection d’agrégats d’anticorps monoclonaux : Analyse HIC (Hydrophobic Interaction Chromatography) en tant qu’approche chromatographique orthogonale.

Les agrégats d’anticorps monoclonaux thérapeutiques peuvent induire une baisse de l’activité thérapeutique et peuvent également avoir un effet immunogénique. La détection des aggrégats est cruciale et nécessite une grande résolution de ceux-ci.

L’application que vous pouvez trouver ci-dessous (rubrique en savoir plus) démontre que l’analyse en HIC avec des particules de 2.5 µm non poreuses offre une résolution extraordinaire des agrégats et est donc une méthode alternative très efficace à la SEC (Size Exclusion Chromatography).


En savoir plus :
– Pour commander ces produits directement sur noter site

contact_tosoh_interchim_blog_0115




Analyse rapide des hétérogéneités de charges des IGG par échanges d’ions


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Dans le contrôle qualité et le suivi du process des anticorps monoclonaux, l’hétérogénéité de charge est un des principaux facteurs à analyser.
La méthode de choix pour y parvenir est la chromatographie par échanges d’ions.

A travers deux exemples portant sur des anticorps monoclonaux les colonnes non-poreuses TSKgel STAT montrent une résolution extraordinaire des variants de charge, et ce, en un temps très court.

En savoir plus :

Contact_Biochromatographie_Interchim_Blog_1014

 





Extraction sur phase solide, comment définir le “volume lit” ou volume de l’adsorbant


Pour en savoir plus sur le développement de méthode SPE, consultez notre article :  Développement de méthode SPE, les principaux paramètres, les étapes du protocole pour un développement de méthode robuste, reproductible et répétable.


Le choix du bon adsorbant est déterminant pour vos préparations d’échantillons, découvrez notre guide pour optimiser vos résultats. Volume, Silices ou polymères, ne laissez rien au hasard…

Quels sont les volumes nécessaires ?

Pour les étapes de conditionnement, de lavage et d’élution, les volumes théoriques sont de 2 à 3 fois le volume de l’adsorbant ou “volume lit” soit :

  • Pour 100 mg de silice 60 A 50 μm : environ 12 μl
  • Pour 500 mg de silice 60 A 50 μm : environ 600 μl
  • Pour 100 mg de polymère : environ 180 μl


Quelles sont les conséquences d’une masse d’adsorbant inadaptée ?
Une masse d’adsorbant trop élevée induit une élution incomplète des composés d’intérêt ou une dilution de l’échantillon par un volume d’élution trop important.
A l’inverse, une masse d’adsorbant trop faible induit une rétention incomplète des composés d’interêt que l’on retrouve dans la fraction de percolation ou dans le solvant de lavage. 
Ces deux situations conduisent à des taux de récupération plus faibles que prévus.

Comment choisir l’adsorbant SPE ? 

Quel que soit l’échantillon à purifier (qu’il soit issu de l’environnement, du domaine pharmaceutique, du domaine cosmétique, de l’agrochimie, ect.), il est fondamental de choisir son adsorbant d’extraction sur phase solide de façon précise.

Le choix de cet adsorbant permettra de définir une sélectivité spécifique aux composés d’intérêt ainsi qu’une capacité de charge suffisante à l’entière adsorption de ceux-ci.

On rencontre en général deux grandes familles :

  • Les silices
  • Les polymères

Leurs caractéristiques étant très différentes, leurs applications, avantages et inconvénients sont divers et variés. 

Les polymères

Ils présentent l’avantage d’être stables chimiquement, ils résistent le plus souvent à un pH compris entre 1 et 14.
Ils sont faiblement sélectifs comparés aux silices greffées (exceptés les polymères échange d’ions).
Ils possédent une capacité de charge bien supèrieure aux silices traditionnelles et permettent la purification d’un très grand nombre de molécules ou de familles de molécules quelle que soit la matrice ( eaux, huiles, plasma, urines, …)
Les polymères à très hautes surfaces spécifiques sont particulièrement efficaces pour la préconcentration de composés polaires.

A savoir : La masse de composés adsorbables peut aller jusqu’à 30% de la masse de polymère contenue dans la colonne. Il est donc possible de réaliser le même travail de purification avec une quantité de polymères 2 à 3 fois moindre que celle d’une silice.  Le volume d’élution est beaucoup plus faible, ce qui conduit à une concentration plus importante, une durée de l’évaporation réduite et par conséquences une préparation d’échantillon plus rapide.

Les silices

Leur stabilité chimique est moins importante que les polymères, elles sont stables à un pH compris entre 2 et 7,5.
Elles sont beaucoup plus sélectives que les polymères avec une capacité de charge moins importante du fait de leur plus faible surface spécifique ( de l’ordre de 3 à 10% de la  masse d’adsorbant), les silices restent toujours des adsorbants de référence très utilisés.

On distingue 4 familles de silices différenciables par leur mode de fonctionnement et leur sélectivité :

  • Silices pour mode ” Phase Inverse” :

En mode “Phase Inverse”, les greffons hydrophobes fonctionnent selon les interactions de type Van des Walls. La purification permet un isolement de familles de composés apolaires ou faiblement polaires.
L’ajout de tampon est préférable lorsque les composés sont ionisables (acides, bases).
Les phases apolaires non post-silanisées (non end capped) donnent, avec les groupements silanols superficiels, des interactions polaires supplémentaires qui peuvent améliorer la rétention des composés contenant des fonctionnalités polaires.
Pour un même éluant, plus la chaîne carbonnée est courte plus la rétention d’un composé est faible.
Pour les composés aromatiques, le greffage phényl présente de meilleures interactions. Le méthanol ou l’acétonitrile sont des solvants d’élution régulièrement utilisés. 

  • Silices pour mode ” Phase Normale” :

Le mode “Phase Normale” reste un compromis très interessant pour la purification de molécules ou familles de molécules dont la structure présente un grand nombre de fonctions polaires. Le choix du solvant est très important et influe directement sur le type d’interaction mis en œuvre pour la purification ( un solvant apolaire favorise les interactions polaires entre l’adsorbant et les composés).

  • Silices pour mode “Echange d’ions” : 

En mode “échange d’ions”, le mécanisme de rétention est l’intéraction ionique. L’extrémité du greffon de l’adsorbant crée une attraction forte avec le ou les composés de l’échantillon possédant une ou des fonctions ionisables antagonistes. L’intération des phases échangeuses d’ions dépend essentiellement du pH et de la force ionique du contre-ions. La force de la liaison sera d’autant plus importante que l’acide et la base qui s’apparient sont forts, ce qui peut être problèmatique pour l’étape d’élution et pour l’obtention d’un bon taux de recouvrement. 
C’est pourquoi, il existe différents greffons échange d’ions :
– Les phases échangeuses d’anions ( SAX) sont  généralement une amine quaternaire très forte. Elles sont utilisées pour extraire les acides faibles portant une ou des charges négatives.
-Les phases échangeuses de cations (SCX) ayant une  fonctionnalité sulfonique sont utilisées pour extraire tous les composés basiques faibles portant une ou des charges positives.
-Les phases échangeuses d’anions (DEAE, DEA, NH2….) sur une base d’amine moins forte que le SAX, sont utilisées pour extraire les acides forts portant une ou des charges négatives.
-Les phases échangeuses de cations (WCX) sont fonctionnalisées par un acide carboxilique et sont utilisées pour extraire tous les composés basiques forts portant une ou des charges positives.

  • Silices pour mode ‘Mixed Mode” :

Une des techniques les plus sélectives des adsorbants silices greffées est celle du “mode mixte” ou “mixed mode”. Le double greffage (échange d’ions et chaînes carbonnées hydrophobes) apporte de nouvelles sélectivités. Les composés d’intérêt, qui doivent impérativement posséder une fonction acide ou basique, sont retenus sur le greffage échange d’ions. Un premier lavage puissant faisant intervenir le pH permet d’éliminer les impuretés ionisables. Il est ensuite possible d’éliminer les autres impuretés retenues sur le greffage hydrophobe par un solvant organique. Cette technique est très utilisée pour l’extraction de composés basiques (médicaments, drogues et métabolites) dans les fluides biologiques (sang, plasma, urines,…)

Comme en “échange d’ions”, il existe différents greffons spécifiques aux composés d’interêt :
-Les phases “mixed mode” (RP/SCX) sont constituées d’un acide fort (sulfonique) et d’un greffon hydophobe. Elles sont utilisées pour extraire les bases faibles portant une ou des charges négatives.
-Les phases “mixed mode” (RP/SAX) sont sur une base d’amine quaternaire et de greffons hydrophobes. Elles sont utilisées pour extraire les acides faibles portant une ou des charges négatives.
-Les phases ” mixed mode” (RP/WCX) sont constituées d’un acide faible (carboxylique) et de greffons hydophobes. Elles sont utilisées pour extraire les bases fortes portant une ou des charges négatives.
-Les phases “mixed mode” (RP/NH2) sont sur une base d’amine faible et de greffons hydrophobes. Elles sont utilisées pour extraire les acides forts portant une ou des charges négatives.

En résumé, les avantages et inconvenients des silices et polymères :

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Le procédé de fabrication Interchim Accurate Bed Technology a été developpé pour garantir une reproductibilité unique de lot à lot et de colonne à colonne.
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Les quantités d’adsorbants sont introduites par pesée avec une précision de +/-1%.
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