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Nano-Anticorps, de nouveaux outils pour l’analyse des protéines, les immunoessais et la thérapie médicamenteuse


Un peu d’histoire

Camel

A la fin des années 80, au cours de travaux pratiques d’extraction d’immunoglobulines, deux étudiants utilisèrent des échantillons de sérums de dromadaires congelés à la place d’échantillons humains qu’ils craignaient être contaminés par le VIH. Quelle ne fût pas leur surprise de visualiser en plus des habituelles immunoglobulines un groupe d’anticorps plus petits qui ne correspondait à rien de connu.

Ne croyant pas un des anticorps variants ou dégradés mais à des anticorps à part entière, deux chercheurs entreprirent de les caractériser. Ils mirent au jour des anticorps dépourvus de chaîne légère et possédant un seul domaine de reconnaissance antigénique, constituant une nouvelle classe, car mis en évidence chez d’autres espèces de camélidés dont les Lamas et les Alpagas.

 

Structure des Nanocorps

Les anticorps de camélidés sont appelés nanocorps (de l’anglais Nanobody), ou anticorps à chaîne lourde (hcAb). En effet, ils sont très petits, car composés d’une seule chaîne lourde. Ils sont dépourvus de chaîne légère ce qui implique que le fragment Fab (fragment antigen binding) de ces anticorps est réduit à un seul domaine variable (VHH : domaine variable des anticorps à chaîne lourde). Ils ne pèsent qu’environ 15 kDa et n’occupent que 4 nm de long et 2.5 nm de large, bien moins que les anticorps conventionnels (150-175KDa) et leurs fragments, Fab (~50 kDa) et scFv (~25 kDa) !

Structure des Nanocorps

Avantages des Nanocorps

La plupart des avantages résultent de leur petite taille :

  • Ces nanocorps sont capables d’atteindre des épitopes cryptiques des cibles, souvent inaccessibles aux anticorps traditionnels 10x plus gros.
  • La stabilité thermique et chimique des nanocorps est bien meilleure que celle des anticorps traditionnels. La solubilité est aussi améliorée. Ce qui permet leur emploi en conditions extrèmes, et de les délivrer in vivo par voie orale et peut-être oculaire, en plus de l’injection intraveineuse et sous-cutanée.
  • Les nanocorps peuvent également être facilement conjugués, par ex avec des agents tueurs de cellules ou des fluorophores.
  • Injectés in vivo, le nanocorps présente une pharmacocinétique très favorable notamment pour l’imaging (élimination rapide par les reins).
  • Dernier point, mais non le moindre, les nanocorps sont beaucoup plus faciles à produire à partir d’une variété d’hôtes (par génie génétique). Ils peuvent aussi être modifiés (humanisés).

Il a été signalé que par ex in vivo, l’élimination des nanocorps par les reins peut masquer le signal d’une cible proche, ou être trop rapide pour permettre une bonne la fixation du nanocorps sur ses cibles. Le marquage fluorescent peut affecter les propriétés de fixation du nanocorps. Des solutions ont néanmoins aussi été proposées pour limiter ces inconvénients.

 

Nanocorps recombinants, des outils avérés et d’avenir prometteur

Les nanocorps peuvent être beaucoup plus que de simples réactifs. Leur obtention par des techniques génétiques et d’expression phagique permet de les cloner, de les sélectionner (phage collections) et de les façonner (constructions), pour optimiser leur affinité, spécificité, solubilité (mutation aa dans le FR2), et aussi de les fonctionnaliser (humanisation, vectorisation, …). Les applications se diversifient, et le futur s’annonce prometteur du diagnostic au thérapeutique. Vous trouverez ci-dessous quelques exemples de leurs utilisations.

Intérêt en recherche : en imagerie, pour l’étude des fonctions des protéines

En 2006 une équipe de chercheurs a, en créant une nouvelle construction appelée « chromobodies » ( nanocorps liés à des protéines fluorescentes), pu suivre en temps réel les cibles intracellulaires endogènes dans les cellules vivantes. Ainsi, grâce à ces constructions, les biologistes peuvent observer de façon dynamique en temps réel les actions de leur protéine d’intérêt.

Les applications, en recherche et à terme en diagnostic, sont bien plus larges : le nanocorps ainsi produits combinés à une protéine fluorescence (gfp) constitue des sondes de petite taille très utile en imagerie moléculaire (notamment SPECT et PET), et en screening.

Les nanocorps ciblant des antigènes intracellulaires (cytosoliques) ont un potentiel particulier en biologie moléculaire de la cellule, et à terme pour identifier de nouvelles cibles diagnostiques ou thérapeutiques : pour étudier l’expression des protéines, ils permettent une imagerie à haute résolution que ne permettent pas les techniques de silencing (down regulation) ou knock-down (Van Audenhove et al., 2014). Ils permettent de mieux corréler la localisation et la fonction des protéines étudiées, jusqu’à l’étude d’interactions protéine-protéines (avec des nanocorps reconnaissant la GFP). Les conditions de pénétration membranaire, et par ex de la barrière hémato-céphalique, restent à investiguer.
L’utilisation de nanocorps a permis l’identification de nouveaux biomarqueurs tumoraux comme par exemple les biomarqueurs de tumeur cérébrale TRIM28 et beta-actin identifiés après analyse en spectrométrie de masse, de complexes nanocorps-antigènes issus d’échantillons de glioblastome multiforme (GMB) (Jovcevska et al., 2014).

Enfin, les nanocorps peuvent améliorer les immuno-tests (Pab, Mab), de par leur haute spécificité, leur stabilité supérieurs, et leur meilleure cinétique. Ils se prêtent aussi aux tests cellulaires ainsi qu’aux immunoPCR.
Leur stabilité a été mise à profit dans des processus requérant des conditions extrêmes de température, de pH ou de force ionique comme le biomarqueur AFP (l’alpha-foetoprotéine) (Chen et al., 2016).

 

Intérêt en immunodiagnostique et thérapeutique

Plusieurs avantages des nanocorps décrits ci dessus en R&D s’appliquent en particulier à l’immunodiagnostique (spécificité, stabilité). Ils peuvent être marqués par des chélates et radioéléments (pour du RIA) ou des fluorophores (pour de la microscopie, de la cytométrie ou du microresau, mais aussi de l’imagerie par scintigraphie, optique, ou par ultrasons). Ainsi, la limite de détection du dosage de l’AFP, biomarqueur de nombreux cancers) passe de 1µg/ml à 0.47ng/ml lorsque des nanocorps anti-AFP sont utilisés (Patris et al., 2014), cette limite peut descendre à 0.0005ng/ ml en immuno-PCR (Chen et al., 2016).

De nombreux projets utilisant des nanocorps sont déjà engagés dans le domaine thérapeutique, comme agent neutralisant d’enzyme ou récepteur, ou comme vecteur d’agent toxique (radioélément, toxine) ou d’agent bioactif (médicament) ciblé sur un organe cible (par ex cancéreux). En octobre 2017, l’entreprise pharmaceutique Ablynx a annoncé des résultats positifs pour son produit de première intention, le caplacizumab, un médicament à base de nanocorps et nanoparticule, issu d’un essai de phase III sur le purpura thrombocytopénique thrombotique acquis (aTTP). Un avantage particulier des nanocorps comparés aux monoclonaux, est de mieux pénétrer les tumeurs, et à terme les cellules (intracorps : voir tableau suivant).

 

Etat de l’art : applications et avancées utilisant les nanocorps

Le tableau ci-dessous est une vue d’ensemble des applications basées sur l’utilisation des nanocorps, leurs avantages et leurs inconvénients lorsqu’ils sont appliqués en tant que produits thérapeutiques, molécules de libération de médicaments, intracorps, outils de diagnostic et/ou d’imagerie, ainsi que les voies de développements actuels.

Nanocorps contre les cibles extracellulaires

Construction :Avantages :
Récepteurs comme cible
EGFR, HER2, c-MET, VEGFR, DR5, CXCR4 / 7
Ligands comme cible
HGF, VEGF, uPA, CXCL11 / 12
Blocs de construction de domaine excellents
Accumulation profonde et homogène dans les tumeurs
Nouveaux épitopes cibles
Limitations :Solutions :
Faible affinité
Elimination rapide dans le sang
Manque d’un fragment Fc Immunogénicité
Constructions multivalentes de nanocorps
Fusion à des nanocorps anti albumine
Addition d’une queue Fc
Humanization
Statut actuel : 
In vitro +++
In vivo:
Xenogreffes ++
Essais cliniques +
Potentiel Thérapeutique

 

Nanocorps pour la libération de médicaments

Construction :Avantages :
Cibles :
VEGFR2, EGFR, c-MET, HER2, MUC1
Libération de toxines
Pseudomonas exotoxin A
Particules de libération
Liposomes, micelles, NANAPs,
polymersomes, polyplexes
Convient pour la conjugaison
Pas de queue Fc
Accumulation tumorale rapide
Peut agir lui-même antagoniste
Limitations :Solutions :
Faible solubilité et / ou stabilité des médicaments
Elimination sanguine rapide affectant principalement la cellule en croissance ou en prolifération
Encapsulation dans des nanoparticules
PEGylation
Viser l’effet de la mort cellulaire
Statut actuel : 
In vitro +++
In vivo :
Xenogreffes ++
Essais cliniques /
Potentiel Thérapeutique

 

Étude fonctionnelle des protéines intracellulaires (intracorps)

Construction :Avantages :
Cibles :
intracellulaires Fascine, cortactine, CapG β caténine, PKCε Vimentine, GFP
Stabilité et activité intracellulaire
Modulation spécifique du domaine/fonction
Facile à fusionner : Aide à la découverte de médicaments
Limitations :Solutions :
Pénétration de la membrane cellulaire requise pour l’usage thérapeutiqueUtilisation d’E.coli enteropathogenic (EPEC)
Nanocorps pénétrant spontanément
Statut actuel : 
In vitro +++
In vivo :
Xenogreffes ++
Applicable pour la recherche en biologie cellulaire

 

Outils de diagnostic (marqueurs du cancer)

Construction :Avantages :
Cibles de biomarqueurs extracellulaires
AFP, CAIX, PMSA
TAG-72, HER2
Grande stabilité
Facile à conjuguer Convient dans plusieurs applications: ELISA, PCR, IHC
Petite taille, propice pour le format puce
Révéler de nouveaux biomarqueurs intracellulaires en IHC
Limitations :Solutions :
Performance accrue souhaitéeSpécifique de l’application
Utiliser un mélange de nanocorps
Statut actuel : 
In vitro +++Applicable pour le diagnostic

 

Imagerie moléculaire

Construction :Avantages :
Cibles
PMSA, MMR, HER2, HGF, VCAM1, CAIX, EGFR
Marqueur
99mTc, 177Lu, 111In, 123I, 68Ga, 89Zr, 124I, 131I
Micro/nanobulles
IRDye800CW, IRDye700DX
Accumulation dans la tumeur rapide et homogène
Elimination sanguine rapide
Conjugaison facile
Imagerie précoce, procédure sûre
Combinaison imagerie et thérapie possible
La chirurgie guidée par l’image devient possible
Limitations :Solutions :
Accumulation dans les reins
Accumulation dans le foie et la rate
Accumulation dans le foie et les intestins
Supprimer l’His-tag
Co-injecter de la gelofusine et / ou de la lysine
Changer d’agent chélateur
Construction spécifique de nanocorps à administrer non marqué
Statut actuel : 
In vitro +++
In vivo :
Xénogreffes +++
Modèles de souris in vivo +++
Essais cliniques + (réussi)
Applicable pour l’imagerie
Potentiel à identifier de nouvelles cibles thérapeutique

D’après I. Van Audenhove, J. Gettemans / EBioMedicine 8 (2016) 40–48

 

Des anticorps de lama comme outils pour la R&D

LamaLes Nanocorps sont utilisés pour leur réaction spécifique sur les antigènes cibles, dans divers immunoassays, imagerie cellulaire et de l’immuno-targetting.

La partie Fc (heavy chain – non spécifique) est utilisée comme un tag (marqueur) que l’on fusionne à une protéine (recombinante) par fusion génétique. Ces LamaFc-Protéines servent d’immunogènes (pour de l’immunisation), et peuvent aussi servir comme antigène marqué dans divers immunoassays (en coating, ou en utilisant des anticorps secondaires -anti Ig de Lama-).

Toujours à l’écoute de la recherche, Interchim® offre désormais des protéines recombinantes liées à des nanocorps de Lama. La plupart de ces protéines sont des cibles thérapeutiques pour la recherche actuelle et future.
Des immunoréactifs issus des hcAbs de Lama sont aussi proposés.

 

En savoir plus :





Anticorps de Lama et protéines taggées IgG Fc de lama


LamaLes anticorps de camélidés fournissent des outils biotechnologiques uniques en recherche (Anticorps entiers ‘hcAbs’, et fragment VHH ou ‘Nanobodies’), avec des applications prometteuses du diagnostique au thérapeutique.

Un peu d’histoire à propos des nanocorps

En 1993, de jeunes chercheurs ont découvert une nouvelle classe d’anticorps à domaine unique chez des chameaux. Ce nouveau type d’anticorps à chaîne lourde (hcIGs ou hcAbs) contient un seul domaine variable (VHH) et deux domaines constants (CH2, CH3). Cette forme rare d’anticorps se prête à la production du fragment spécifique VHH, le nanocorps qui est une alternative fascinante aux anticorps conventionnels.
Ces nanocorps peuvent être produits par immunisation classique d’animaux camélidés, mais aussi par génie génétique.
Ils présentent un intérêt tant en recherche (de l’analyse in vitro à l’imagerie moléculaire) qu’en diagnostic (comme sonde) et thérapeutique (comme médicament potentiel).

Principaux avantages des nanocorps :

  • En raison de leur petite taille, les nanocorps peuvent se lier à des épitopes difficiles d’accès aux anticorps traditionnels. Ils pénètrent aussi mieux les cellules et permettent de détecter ainsi des cibles intracellulaires ou masquées.
  • La stabilité des nanocorps est bien meilleure que celle des anticorps traditionnels.
  • Les nanocorps peuvent être facilement conjugués pour les fonctionnaliser
    (avec des agents fluorescents pour détecteur leur cible, avec des agents toxiques pour les adresser à des cellules et les tuer, ou avec des protéines, des résines, …)
  • Les nanocorps sont plus faciles à produire et modifier/optimiser
    par génie génétique, à partir d’une variété d’hôtes, de façon contrôlée.

Les Nanocorps sont utilisés pour leur réaction spécifique sur les antigènes cibles dans divers immunoassays, imagerie cellulaire et de l’immuno-targetting.
La partie Fc (heavy chain – non spécifique) est utilisée comme un tag (marqueur) que l’on fusionne à une protéine (recombinante) par fusion génétique. Ces LamaFc-Protéines servent d’immunogènes (pour de l’immunisation), et peuvent aussi servir comme antigène marqué dans divers immunoassays (en coating, ou en utilisant des anticorps secondaires -anti Ig de Lama-).

 

Protéines fusionnées avec les IgG Fc de lama :

Concues pour de l’immunisation (et d’autres applications: immuno-targetting, immunoassays)

  • Immunogénicité de la protéine taguée améliorée : Le tag ‘IgGFc’ a une faible immunogénicité, mais il peut favoriser la dimérisation des protéines
  • Pharmacocinétique : longue demi-vie et bonne stabilité
  • Haute pureté (Fig 1)
  • Haute activité (Fig 2)
  • Faible taux d’endotoxine (< 10 UE / mg).
Lama IgG2b Fc tag HumaineLama IgG2b Fc tag Humaine-2
Fig 1 : PD-1, Llama IgG2b Fc tag humaine (#PD1-H5259 ) sur SDS-PAGE dans des conditions dénaturantes (R). La pureté de la protéine est supérieure à 95%.BAFF His Tag humaine immobilisée, (#BAF-H5248 ) à 5 μg/mL (100 μL/puits) peut se lier à la BCMA Llama IgG2b Fc Tag Humaine, ( BCA-H5259 ) plage de 0,02-0,4 ng/mL.

 

> Liste des protéines conjuguées avec le tag lama IgG Fc (exclusif) :

MoleculeCat. No.Product DescriptionStructure
BCMABCA-H5259Human BCMA, Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructure BCMA
CD19CD9-H5250Human CD19 (20-291), Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructure CD19
CD30TN8-5250Human CD30, Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructure CD30
CD38CD38-H5252Human CD38, Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructureCD38
CD47CD7-H5251Human CD47, Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructure CD47
LAG-3LA3-H525cHuman LAG-3, Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructure LAG-3
PD-1PD1-H5259Human PD-1, Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructure PD1
PD-L1PDL-H5250Human PD-L1, Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructure PD-L1
Siglec-2SI2-H525aHuman Siglec-2, Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructure Siglec
Siglec-3CD3-H5259Human Siglec-3, Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructure Siglec-3

Accédez à plus de protéines recombinantes taggées LlamaFc.

 

Pour une utilisation future de biopanning en phage display, les protéines biotinylées correspondantes sont recommandées. Ces protéines peuvent être fixées à des surfaces recouvertes de Streptavidine (ex Microplaques ELISA) pour du criblage à haut débit.

> Liste des protéines conjuguées avec le tag lama IgG Fc (exclusif) :

MoleculeCat. No.Product DescriptionStructure
BCMABC7-H82F0Biotinylated Human BCMA / TNFRSF17 Protein, Fc Tag, Avi Tag (Avitag™)Structure BCMA Fc Avitag
CD30CD0-H82E6Biotinylated Human CD30 / TNFRSF8 Protein, Avi Tag (Avitag™)Structure CD30 Avi His Fc
CD38CD8-H82E7Biotinylated Human CD38 Protein, Avi Tag (Avitag™)Structure D38 Avi His
CD47CD7-H82E9Biotinylated Human CD47 Protein, Avi Tag (Avitag™)Structure CD47 His Avi
LAG-3CD7-H5251Biotinylated Human LAG-3, Mouse IgG2a Fc Tag, (Avitag™)Structure LAG-3 mFc Avi
PD-1LA3-H525cBiotinylated Human PD-1, (recommended for biopanning)Structure PD-1 Avi His
PD-L1PD1-H5259Biotinylated Human PDL-1/B7-H1, (recommended for biopanning), Avi Tag (Avitag™)Structure PD-L1 Avi His
Siglec-2PDL-H5250Biotinylated Human Siglec-2, Fc Tag, (Avitag™)Structure Siglec-2 Fc Avi
Siglec-3SI2-H525aBiotinylated Human Siglec-3 / CD33 Protein, (Avitag™)Structure Siglec-3 Avi His

Accédez à plus de protéines recombinantes Avi-taggées.

 

Immunoréactifs de lama :

> Anticorps secondaires de Lama

Les anticorps de lama immunisés envers des IgG de différentes espèces et purifiés par affinité puis marqués par différents marqueurs fluorescents, la biotine ou l’HRP, sont utilisés dans les immunoassays.

Llama AbAnti Mouse IgG(H+L)
Lyo(1mg) or 2mg/ml (50&500μl)
Anti Rabbit IgG(H+L)
Lyo(1mg) or 2mg/ml (50&500μl)
CF488A204542449
CF5682045520450
CF5942045620451
CF640R2045720452
CF6472045820453

 

> Anticorps de Lama immobilisés

Llama Igg Coupled 4% Agarose Beads OOIB00006, 2 ml

 

> Anticorps de Lama pour Controles

 Unconj.BIOTINFITCHRP
Control Normal Llama IgGXR-8001XR-8013XR-8005XR-8009
Control Normal Llama IgG1XR-8002XR-8014XR-8006XR-8010
Control Normal Llama IgG2XR-8004XR-8016XR-8008XR-8012
Control Normal Llama IgG3XR-8003XR-8015XR-8007XR-8011

 

> Sérum et Ig de Lama

Normal Llama serumOOIB00013, 2mlOOIB00012, 10ml
Llamma IgOOIB00043, 10mg– – –
Llamma IgGOOIB00044, 10mg– – –

 

> Anticorps secondaires anti Ig de Lama

Anti-Llama IgG (H+L)Goat antiRabbit anti
Unconjugated41R-1045, 1 mg41R-1046, 1mg
HRP43R-1284, 1 mg43R-1290, 1mg
AP43R-1281, 500 μg43R-1287, 500 μg
Biotin43R-1282, 1 mg43R-1288, 1 mg
FITC43R-1283, 1 mg43R-1283, 1 mg
Rhodamine43R-1285, 1 mg– – –
RPE13415, 1 unité– – –
APC13393, 1 unité– – –

Accédez à plus d’immunoréactifs et anticorps de Lama.

 

En savoir plus :

  • Voir l’article Nano-Anticorps
  • N’hésitez pas à nous demander des produits & services similaires: Camel/Alpaga antibodies, custom production, antibody purification …

A savoir que les VHH peuvent être produits à partir d’une large gamme d’immunogènes (nucléotides naturel ou modifié, peptide avec ou sans modification post-traductionnelle, protéine, microorganisme, haptènes…).

Cela passe par l’immunisation de lamas, puis la construction d’une bibliothèque de phage display (phages comportants l’ADNc codant pour le VHH qui sont utilisée pour présenter les VHH dans des tests), la sélection des phage/VHH d’interêt, et enfin la production (qui peut être à grande échelle).

Les nanocorps ont une plus grande stabilité que les anticorps classiques,
. conformationnelle et thermique (jusqu’à 60°C / 140°F)
. et chimique (il supportent une plus large gamme de pH).





Guide : choisir ses marqueurs fluorescents de la surface cellulaire dans les cellules vivantes ou fixées


Logo FluoProbes

La coloration membranaire est très utile pour étudier la délimitation des cellules, la morphologie, le suivi ou la filiation des cellules, dans les études par imagerie multicolore. Les chercheurs sont toujours à la recherche de colorants appropriés à utiliser dans diverses conditions de viabilité, de fixation et de colorations expérimentales dictées par leur application.
FluoProbes® offre un large choix de colorants hautement fluorescents et photostables pour visualiser les structures cellulaires dans les expériences de marquages multicolores. Cet article présente 4 types de marqueurs les plus utiles pour colorer la surface des cellules :

① Colorants classiques :  DiO, DiI, DiA, DiD, DiB et DiR

Schema Colorants ClassiquesLes colorants carbocyanines lipophiles marquent les membranes dans une grande variété de cellules vivantes ou fixes. Procédure de coloration simple, les colorants peuvent être ajoutés directement aux milieux de culture normaux des cellules adhérentes ou en suspension. La coloration est non toxique et stable, avec très peu de transfert de colorant entre les cellules, ce qui les rend aptes au marquage cellulaire, au suivi des populations de cellules en mélange et aux études de fusion cellulaire.

Les cellules peuvent être fixées au formaldéhyde avant ou après la coloration, mais cette dernière tolère mal la perméabilisation ou la fixation au méthanol. Les colorants ne sont donc pas faciles à combiner avec la coloration intracellulaire par immunofluorescence (IF). Les colorants ne fonctionnent pas sur les bactéries ou les levures. Ils sont disponibles du bleu au proche infrarouge :

DIB, blue dye (353/442nm)FP-YS286010 mg
DIO, DIOC18(3) (484/501nm)FP-46805A50 mg
DiA (491/613nm)FP-66096A25 mg
Dil, DiIC18(3) (551/566nm)FP-46804A50 mg
DiD, DilC18(5) (644/663nm)FP-22574A50 mg
DiD, DilC18(5) oil for microinjection (644/663nm)FP-92909A25 mg
DiR, DilC18(7) (748/780nm)FP-69084A25 mg

 

Bibliographie :

BMC_Cell_Biology_interchim_blog1118Khan, J. et al., Aurora kinase-C-T191D is constitutively active mutant, BMC Cell Biology, 13:8 (2012)
 Radiation_Research_interchim_blog1118Lacoste-Collin L. et al., Effect of Continuous Irradiation with a Very Low Dose of Gamma Rays on Life Span and the Immune System in SJL Mice Prone to B-Cell Lymphoma, Radiation Research, Volume 168, Issue 6 (2007)
 BioMed_Research_International_interchim_blog1118Pacor S. et al., Effects of Two Fullerene Derivatives on Monocytes and Macrophages, BioMed Research International, 915130, 13 pages (2015)
 Protein_&_Peptide_Letters_interchim_blog1118Pelillo C. et al., Cellular Internalization and Cytotoxicity of the Antimicrobial Proline-rich Peptide Bac7(1-35) in Monocytes/Macrophages, and its Activity Against Phagocytosed Salmonella typhimurium, Protein and Peptide Letters, Volume 21, Number 4, pp. 382-390(9) (2014)
 Journal_of_Physical_Chemistry_interchim_blog1118Revillod G. et al., Multipolar Contributions to the Second Harmonic Response from Mixed DiA−SDS Molecular Aggregates, J. Phys. Chem. C, 112 (7), pp 2716–2723 (2008)
 Tianqing_Xiong_interchim_blog1118Tianqing Xiong et al., Contamination of Phenylobacterium in several human and murine cell cultures, Acta Microbiologica Sinica, 55(2): 176-186 (2015)

 

② Colorants carbocyanines plus lipophiles : Neuro-DiI, Neuro-DiO

Les colorants FluoProbes® carbocyanines sont conçus pour une diffusion plus rapide dans les membranes cellulaires. Cette propriété est particulièrement utile pour marquer les neurones dans les tissus.

Neuro-DiO, better solubility in membranes (484/501nm)FP-AM331A25 mg
Neuro-DiO in vegetable oil for microinjection (484/501nm)FP-BA641A0,2 ml
FAST DiO Solid; DiO 9,12-C18(3) (485/500nm)FP-96427A5 mg
Neuro-DiI Fast Plasma Membrane Dye (549/565nm)FP-AM330A25 mg
FAST DiI oil for microinjection; DiID9,12-C18(3),
Dilinoleyl DiI (549/565nm)
FP-87188A5 mg
FAST DiI solid; DiI 9,12-C18(3) (550/565nm)FP-12792A5 mg

 

③ Marqueurs de surface cellulaire pouvant être fixées : FP Membrane Marker FX

Ces marqueurs contiennent une amine aliphatique pour pouvoir être fixée par réaction d’un aldéhyde (formaldéhyde, glutaraldéhyde…). Cette série des FPMMarkers complète ainsi les carbocyanines lipophiles, peu compatibles avec la fixation des cellules.

FP Membrane Marker 1-43 FX (510/626nm)FP-T2982A1 mg
FP Membrane Marker 1-44 FX (480/598nm in membranes)FP-AN100A1 mg
FP Membrane Marker 2-10 FX (506/620nm)FP-AM307A1 mg

Bibliographie :

BBA_interchim_blog1118Bucki R. et al., Involvement of the Na+/H+ exchanger in membrane phosphatidylserine exposure during human platelet activation,
BBA – Molecular and Cell Biology of Lipids, 1761:2, p. 195-204 (2006)

 

④ Lectines marquées pour la coloration de la surface cellulaire : WGA et Con A

Conjugués à nos colorants FluoProbes® brillants et photostables, les lectines marquent les glycoprotéines à la surface des cellules vivantes ou fixées. La coloration à la lectine peut également résister à la fixation et à la perméabilisation. Dans les cellules pré-fixées et perméabilisées, les lectines colorent à la fois la surface cellulaire et les organites des voies sécrétoires.
Les lectines WGA et Con A sont largement utilisées pour la coloration de la surface cellulaire dans les cellules de mammifères et sont également utiles pour les colorations de bactéries Gram+ et les levures. La coloration à la lectine peut être dépendante du type de cellule.

FluoProbes® 350 – WGA (353/432nm)FP-A0IKZ05 mg
FluoProbes® 488 – WGA (494/517nm)FP-B0E9G01 mg
FluoProbes® SR101-Con A (583/603nm)FP-MT00005 mg
FluoProbes® 647H – WGA (655/676nm)FP-B0E9F01 mg

Bibliographie :

AEM_interchim_blog1118Midelet G. et al., Transfer of Microorganisms, Including Listeria monocytogenes, from Various Materials to Beef, Appl Environ Microbiol. 68(8): 4015–4024 (2002)

 

Les références et les fiches techniques des Fluoprobes® sont disponibles en ligne sur www.interchim.com.

Pour tout renseignement complémentaire, vous pouvez contacter notre support technique au 04 70 03 73 06 ou par email à interbiotech@interchim.com.





6 choses à savoir pour une coloration optimale des gels d’acides nucléiques : les solutions GelRed et GelGreen


Six choses à savoir pour une coloration optimale des gels d’acides nucléiques : les solutions GelRed® et GelGreen®

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Pour une alternative plus sûre au bromure d’éthidium (BET) pour vos gels d’ADN, les GelRed® et GelGreen® sont les seuls colorants de gel imperméables aux membranes cellulaires. Des tests approfondis démontrent que les colorants GelRed® et GelGreen® sont non toxiques, non mutagènes et non dangereux pour leur élimination. En outre, ils offrent une sensibilité plus élevée et un faible bruit de fond.

Schema_interchim_blog0918

L’utilisation la plus courante des colorants d’acide nucléique GelRed® et GelGreen® est dans les gels d’agarose pré-coulés, où les colorants sont ajoutés à l’agarose fondu pendant la préparation du gel.
Cet article aborde les points à garder à l’esprit pour tirer le meilleur parti de ces colorants plus performants à bien des égards, et résoudre d’éventuels problèmes apparus par méconnaissance de leurs spécificités.
Ainsi, en raison de leur plus grande taille conçue pour améliorer la sécurité, la migration des bandes d’ADN dans les gels pré-coulés peut parfois être affectée. Certains échantillons, tels que l’ADN coupé par des enzymes de restriction, peuvent migrer anormalement dans les gels pré-coulés avec le GelRed® ou le GelGreen®.

 

① GelRed® et GelGreen® sont des colorants plus gros que le BET, une caractéristique de conception liée à leur sécurité

C’est la raison pour laquelle l’ADN en trop grande quantité entraîne des bandes courbées (smears), et une migration d’ADN aberrante. La quantité de charge recommandée pour les échantillons de concentration connue ou de marqueurs de poids moléculaire d’ADN est de 50-200 ng / puits. Pour les échantillons de concentration inconnue, la charge de 1/2 à 1/4 de la quantité habituelle d’ADN résout habituellement les problèmes de migration.

Coloration de dilutions en série de ladder d’ADN 1 kb  (200 ng, 100 ng, 50 ng et 25 ng) en gel pré-coulé d’agarose 1% dans un tampon TBE. À gauche : Comparaison du GelRed® et du bromure d’éthidium (EtBr). À droite: Comparaison du GelGreen® et du Colorant Safe.

② GelRed® et GelGreen® sont des colorants ultra-sensibles, plus sensibles que le BET

Des quantités d’ADN faibles (0,1 ng ou moins) peuvent être détectées de manière fiable. Le chargement d’une quantité élevée d’ADN n’est pas nécessaire, et peut entraîner au contraire des problèmes de migration de l’ADN. Un chargement de plus faibles quantités d’ADN donne une meilleure séparation et des bandes plus nettes, économisant les échantillons précieux, les marqueurs d’ADN et diminuant ainsi les coûts.

 

③ GelRed® et GelGreen® donnent une coloration plus homogène et stable à travers le gel

Les  GelRed® et GelGreen®, plus lourds, ne migrent pas à travers le gel aussi vite que le BET. Ainsi ils évitent la perte de coloration, ou la faible coloration des bandes d’ADN de faible poids moléculaire observée avec le BET. Avec les GelRed® et GelGreen®, 1l n’est pas nécessaire d’ajouter un colorant supplémentaire au tampon d’électrophorèse.
Par ailleurs, la coloration par le GelRed est aussi plus homogène entre expériences du fait de sa meilleure stabilité que les colorants ‘Safe’.

 

④ L’utilisation d’un pourcentage de gel plus faible et une capacité tampon plus élevée peuvent améliorer la résolution de bande avec les GelRed® et GelGreen®

Comme les GelRed® et GelGreen® sont des colorants plus gros que le BET, l’ADN de haut poids moléculaire se sépare mieux sur des gels d’agarose à pourcentage inférieur.
Une résolution séparative insuffisante peut aussi être améliorée par un tampon plus fort et salin : Essayez le TBE si vous utilisez le TAE.

 

⑤ Stocker les solutions concentrées de GelRed® et GelGreen® à température ambiante.
Évitez de stocker des gels pré-coulés avec les GelRed® ou GelGreen® à 4°C.

Une faible fluorescence, une diminution de la performance du colorant au cours du temps ou un film de colorant restant sur le gel après la coloration sont des indications que les colorants peuvent avoir précipités, notamment à froid. Chauffer les solutions de colorant à ~ 50°C, et bien mélanger en vortexant.
Les gels précoulés contenant les GelRed® ou GelGreen® peuvent être stockés pendant une semaine ou un mois, respectivement, avant utilisation. Nous recommandons de conserver les gels à température ambiante (et non +4°C qui favorise la précipitation des colorants), dans l’obscurité et notamment s’ils ont été migré.

 

⑥ La post-coloration élimine toute possibilité d’interférence du colorant avec la migration de l’ADN

Avec des gros colorants à haute affinité pour les acides nucléiques comme les GelRed® et GelGreen® qui peuvent affecter la migration de l’ADN pendant l’électrophorèse, la post-coloration des gels est recommandée pour des séparations plus précises et résolutives . La post-coloration est également recommandée pour (i) une charge supérieure de la quantité recommandée d’ADN, (ii) une utilisation de tampons de charge contenant du SDS, qui peut contribuer aux bandes courbées (smears), ou (iii) un problème persistant de migration de bandes dans les gels pré-coulés avec les GelRed® ou GelGreen®. La post-coloration peut prendre de 5 à 30 minutes, selon la quantité d’ADN présente, et la solution peut être réutilisée.

Les références et les fiches techniques des  GelRed® et GelGreen® sont disponibles en ligne sur www.interchim.com.

Pour tout renseignement complémentaire, vous pouvez contacter notre support technique au 04 70 03 73 06 ou par email à interbiotech@interchim.com.





Coup de projecteur sur des références citant FluoProbes – Tous Les Spectres par Nature


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Des articles publiés récemment utilisent les sondes FluoProbes® by Interchim® :

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FluoProbes® 7-Aminoactinomycin D (7-AAD)

Pour le marquage de noyaux de cellules nécrotiques

Publication1_interchim_blog0318

Leverrier-Penna S. et al., Ibuprofen is deleterious for the development of first trimester human fetal ovary ex vivo, Human Reproduction, Volume 33, Issue 3, Pages 482–493 (2018)
+ d’info

[…]following exposure to ibuprofen, we have shown a reduction of the overall number of ovarian cells, effect coupled to a dramatic decline of cell proliferation and a significant enhancement of apoptosis, but not necrosis. This suggests that ibuprofen compromised both proliferation and viability, ultimately resulting in a loss of ovarian cells. […]

TitreFluoProbes_7-AAD_interchim_blog0318
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Autres sondes pour ADN/ARN dans le catalogue Interchim® Biosciences pages G. 26-G.34.

 

FluoProbes® TMRM

Pour la mesure du potentiel membranaire mitochondrial

Soueid M., et al., Delivery devices for exposure of biological cells to nanosecond pulsed electric fields, Medical & Biological Engineering & Computing, Volume 56, Issue 1, pp 85–97 (2018) + d’info

[…] They were loaded with 3 nM of TMRM (Tetramethylrhodamine Methyl Ester, FluoProbes) over 20 min, and co-labeled with 3 μM of 7-AAD […]

TitreFluoProbes_TMRM_interchim_blog0318
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FluoProbes® 488 NHS-ester

Pour le marquage des peptides et protéines

Crosnier de Lassichere C., et al., Online Preconcentration in Capillaries by Multiple Large-Volume Sample Stacking: An Alternative to Immunoassays for Quantification of Amyloid Beta Peptides Biomarkers in Cerebrospinal Fluid, Anal. Chem., 90 (4), pp 2555–2563 (2018) + d’info

[…]containing Fluoprobe 488 NHS to obtain the desired concentration with a molar ratio of 200:1 (Fluoprobe / peptide) […]


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FluoProbes® 488 Donkey anti-Mouse IgG

Anticorps secondaire utilisé en immunofluorescence

Maurel C. et al., Mutation in the RRM2 domain of TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis with rapid progression associated with ubiquitin positive aggregates in cultured motor neurons, Amyotrophic Lateral Sclerosis and Frontotemporal Degeneration, Volume 19, Issue 1-2 (2018) + d’info

[…] (C) Co-localisation of GFP-TDP-43 WT and GFP-TDP-43 N259S with ubiquitin in aggregates in NCS34 cells and (D) primary motor neurons (anti Ub: PAD1, sc-8017, 1/50; secondary antibody FluoProbes 488 donkey against mouse IgG: FP-SA4110[…]


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FluoProbes® 647H Goat anti-Rat IgG

Anticorps secondaire utilisé en immunofluorescence

Kuo MS, et al., A novel antibody-based approach to detect the functional ERCC1-202 isoform, DNA repair, Volume 64, Pages 34-44 (2018)

+ d’info


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L’immunothérapie « immune checkpoints » et l’immunothérapie « adoptive »


« Immune checkpoints » et Cellules CAR-T

Il existe différents types d’immunothérapies des tumeurs. Cet article se focalise sur deux d’entre elles dont les résultats très encourageants en font des axes majeurs dans la recherche en Oncologie :

  • L’immunothérapie « immune checkpoints » : fait appel à des anticorps monoclonaux ciblant des points de contrôle et de régulation du système immunitaire (« immune checkpoints »). En bloquant ces points de contrôle, ces anticorps privent la tumeur de ses moyens d’échappement à l’immunité anti-tumorale.
    On retrouve dans ce groupe des molécules déjà utilisées cliniquement comme le Nivolumab (anti PD-1 de Bristol Myers Squibb) ou le Druvalumab (anti PD-L1 d’Astra Zeneca).
  • L’immunothérapie « adoptive » : Elle repose sur l’injection au patient de cellules CAR-T (lymphocytes T autologues, modifiés génétiquement in vitro pour exprimer un récepteur chimérique visant à les rendre plus efficaces dans leurs fonctions effectrices anti-tumorales).

Les « immune checkpoints »

Les « immune checkpoints » sont des protéines qui délivrent un signal de régulation lors de la reconnaissance de l’antigène par le récepteur des lymphocytes T (TCR) au cours de la réaction immunitaire.

SchemaIinteractionImmuneCheckpoint

Ce signal peut :

  • stimuler la réponse immunitaire en cours (lorsqu’il fait intervenir des checkpoints activateurs, comme : CD28, ICOS ou CD137)
  • ou au contraire, l’inhiber (lorsqu’il fait intervenir des checkpoints inhibiteurs, comme : PD1, CTLA-4 ou VISTA).

En temps normal, ces protéines jouent un rôle primordial pour la tolérance du soi, mais dans le cas du cancer, elles peuvent permettre à la tumeur d’échapper à la réponse immunitaire.
L’étude des voies de régulation par ces protéines « checkpoint » dans le lymphocyte T, constitue une nouvelle approche thérapeutique permettant d’améliorer la réponse immunitaire anti-tumorale et ouvre ainsi de nouvelles perspectives dans la lutte contre le cancer.
Vous trouverez ci-dessous un diagramme représentant les principales voies de régulation connues à ce jour.

InterchimFaciliteVosRecherches_interchim_blog0917

ImmuneCheckpoint-ProSci_interchim_blog0917

Les Cellules CAR-T

Les cellules CAR-T (Chimeric Antigen Receptor T-Cell) sont des lymphocytes T autologues, prélevés chez le patient puis modifiés génétiquement in vitro afin de leur faire exprimer un récepteur chimérique visant à les rendre plus efficaces dans leurs fonctions effectrices anti-tumorales.

Ce récepteur chimérique est constitué :

  • d’une partie extra-cellulaire chargée de la reconnaissance de l’antigène tumoral (grâce à un anticorps monoclonal : scFv le plus souvent)
  • d’une partie transmembranaire (hélice alpha hydrophobique : domaine transmembranaire du CD3-zeta ou CD28 le plus souvent)
  • et d’une partie intra-cellulaire chargée de l’activation des lymphocytes après fixation sur les cellules tumorales (activation grâce à la présence des domaines ITAMs (Imunoreceptor tyrosine-based activation motif) du CD3-zeta le plus souvent, et à l’association à des facteurs co-stimulants comme 4-1BB ou OX40)

Depiction3CARsgenerations_interchim_blog0917
Représentation schématique des différentes générations de récepteurs chimériques

A l’heure actuelle, les immunothérapies par cellules CAR-T sont principalement utilisées pour le traitement de certaines formes de leucémies mais des essais pré-cliniques sont en cours pour différentes cibles dans d’autres cancers.
L’étendue de cette thérapie à d’autres cancers (y compris aux tumeurs solides) réside notamment dans la découverte des cibles les plus adaptées et les plus spécifiques possibles afin d’éviter les effets néfastes sur d’autres organes du patient.





Zika : anticorps et proteines


Le moustique tigre principal vecteur de la maladie Zika

Le moustique tigre principal vecteur de la maladie Zika

Le virus Zika a été isolé en 1947 à partir d’un singe habitant la forêt Zika située en Ouganda.
En 1952, une étude sérologique a montré que ce virus infectait l’homme : 50 personnes sur 84 testées avaient développé des anticorps contre ce virus.
Zika s’est répandu progressivement à beaucoup de pays africains et asiatiques.
Depuis avril 2015, la propagation de Zika s’est brutalement accélérée.
Après être apparu au Brésil, ce virus s’est propagé à une grande partie de l’Amérique du Sud et Centrale ainsi qu’aux Caraïbes. L’accélération de sa propagation, les graves syndromes neurologiques qu’il provoque ont poussé l’OMS à déclarer Zika comme une urgence de santé publique de portée internationale.

Interchim propose une offre complète, unique sur le marché,  dédiée à l’étude de la pathologie Zika (anticorps, protéines recombinantes, kits)

Microcéphalie: les bébés victimes de cette malformation néonatale présentent une taille de tête beaucoup plus petite que celle d'autres bébés du même âge.

Microcéphalie: les bébés victimes de cette malformation néonatale présentent une taille de tête beaucoup plus petite que celle d’autres bébés du même âge.

Symptômes de l’infection du virus zika

Dans la plupart des cas, la maladie est asymptomatique seule 1 personne sur 5 montre des symptômes semblables à ceux d’une grippe à savoir fièvre, courbatures, maux de tête, et parfois une éruption cutanée.

Zika est surtout dangereux chez les bébés nés infectés par transmission de la mère à l’enfant et est à l’origine des malformations congénitales ou microcéphalie (petite tête ou développement incomplet du cerveau).
Chez l’adulte infecté, Zika est associé à des troubles neurologiques, incluant des cas du syndrome de Guillain-Barré (SGB).

 

Nature du virus Zika : Un flavivirus de la même famille que la dengue

Le virus Zika (ZIKV) est un membre de la famille des Flaviviridae, transmis par les moustiques tigre déjà infectés du genre Aedes, tels que A. aegypti et A. albopictus. Dans certains cas, le virus peut se transmettre par voie sexuelle.

VirusZika-2Zika fait partie du même groupe de virus transmettant la dengue, la fièvre jaune, l’encéphalite japonaise, et les virus du Nil occidental. Comme les autres flavivirus, le virus Zika, de forme icosaédrique est pourvu d’une enveloppe et possède un ARN génomique simple brin, de polarité positive non segmentée. Il existe deux lignées du virus Zika: la lignée africaine, et la lignée asiatique. Les études phylogénétiques indiquent que la propagation du virus dans les Amériques est plus étroitement liée à la souche asiatique.

Des vaccins efficaces existent contre le virus de la fièvre jaune, l’encéphalite japonaise, et les tiques encéphalite, mais il n’y a pas de vaccin pour le virus Zika.

 

Nature du Virus : Un génome codant pour une polyprotéine

Le virus Zika est un ARNss (25-30 nm, ~ 11kb) de polarité positive.SchemaZika-1virus Le génome du virus Zika code pour une polyprotéine qui sera clivée :

en capside (C), en précurseur de membrane (prM), en protéine de l’enveloppe (E), et en protéines non structurales (NS1-5). La protéine E couvre la majorité de la surface du virion et est impliquée dans les étapes de la réplication, incluant la liaison cellulaire à l’hôte et la fusion membranaire.
NS1, NS3, NS5 sont de grosses protéines hautement conservées tandis que les protéines NS2A, NS2B, NS4A, et NS4B sont des protéines plus petites et hydrophobes.
Comme pour les autres flavivirus, l’ensemble des anticorps dirigés contre les protéines de structure et les protéines non structurales sont détectés lors de l’infection par le virus zika. La famille des flavivirus partage 40 à 60% de la séquence virale.

Des vaccins sont disponibles contre JEV, VFJ et la dengue. Par conséquent, il est important d’exclure la présence d’anticorps Zika dus à la vaccination et / ou infection par des virus apparentés.

 

Mécanisme d’action : SEC343MUAXL, une porte d’entrée possible pour Zika

SchemaZika-2Des études récentes ont montré que la protéine AXL (du mot grec anexelekto, c’est-à-dire non contrôlée) pouvait être une cible de reconnaissance possible de ce virus.
AXL est un récepteur tyrosine-kinase qui transmet les signaux de la matrice extracellulaire vers le cytoplasme après liaison de facteurs de croissance comme la protéine GAS6 (growth-arrest-specific gene 6) vitamine K dépendante.
Gas6 (GAS6; 721-aa humain, souris 674-aa) est une protéine contenant le domaine de l’acide gamma-carboxyglutamique (Gla) supposé être impliqué dans la stimulation de la prolifération cellulaire.
Le gène AXL (?? 894-aa humaine; 1-451-aa de domaine extracellulaire) est conservé entre les espèces de vertébrés et est fortement exprimé chez l’homme dans les cellules gliales radiales, les astrocytes, les cellules endothéliales et microgliales dans le cortex en cours de développement et chez les cellules progénitrices de la rétine en développement.

Pour vos recherches, Interchim offre toute une batterie de protéines recombinantes AXL (humaines et murines), ainsi que des anticorps monoclonaux et polyclonaux anti-AXL afin de comprendre l’importance de l’association AXL avec une infection du type Zika.

 

En savoir plus :

Zika_anticorps_proteine_interchim_blog1112Consultez ou téléchargez notre brochure dédiée au virus Zika et retrouvez dans celle-ci :

  • Toutes nos protéines recombinantes des protéines Zika
  • Tous nos anticorps dirigés contre les protéines Zika




Le Système de Purification Magnétique AbPure™ est arrivé !


Système de purification universel et rapide basé sur des nanoparticules pour nettoyer les anticorps.

abpure magnetic purification anticoprs

  • Rapide et facile à utiliser
  • Purifie de 20 à 200ug d’anticorps
  • Haute capacité: 70-90%
  • Flexible et fiable

Idéal pour nettoyer des anticorps commerciaux qui contiennent des additifs  (ex: BSA, glycine, tris, et azide); lesquels  interfèrent avec mes marquages et couplage

Le kit AbPure™ de Purification Magnetique est une solution universelle développée pour de petites quantités d’anticorps.
Il contient des tampons de composition nouvelle pour être compatible avec les applications de marquage aval.  
Les substances indésirées sont éliminées du tampon de stockage de l’anticorps en collectant les billes sur un support magnétique, en les lavant, puis en éluant l’anticorps.

Le kit AbPure économise du temps au chercheur, améliore le rendement en anticorps, et facilite la production de conjugués.

En savoir plus sur le kit AbPure™ Magnetic  :

  • AbPure™ Magnetic Purification System | ref : 0C3410-265-0200 |1 Kit
  • Magnetic stand | ref : 0C3420-265-1006 | 1 unité




La PEGylation : définition, principes, méthodes et avantages


Qu’est ce que la PEGylation ?

PEGylationLa PEGylation désigne les techniques de modification de composés ou supports, par des chaines polymériques d’EthyleneGlycol (ou PolyEthylene Oxide, ou polyoxyethylene) ainsi que leurs applications.
Introduites dans les années 1970 pour améliorer la biodisponibilité de médicaments (durée de vie plasmatique, réduction de l’immunogénicité), ces techniques se sont diversifiées, embrassant des applications variées de la synthèse organique aux biomatériaux ou la culture cellulaire. 

Cet article rappelle quelques avantages majeurs générés par la PEGylation, puis présente quelques méthodes de PEGylation, notamment des agents PEG versus PEO, et leur  couplage par chimie click.

 

Principe et méthode de PEGylation

Pegyler une molécule ou un support consiste à la ou le greffer avec des chaines hydrophiles, ce qui induit diverses modifications physicochimiques au niveau moléculaire, principalement l’hydrophilicité, mais aussi le PM, l’encombrement stérique… Corolairement, au niveau macroscopique, on obtient des modifications physiques, biochimiques et biologiques mises à profit en industrie (matériaux), pharmaceutique (médicaments, vaccins), médical (prothèses)…

Le greffage est fait  usuellement par liaison covalente. Cependant, il est parfois réalisé par adsorption, ou piégeage (gels).

 

Avantages de la PEGylation

1/ L’amélioration des propriétés de la biomolécule

Modifier une biomolécule par un agent PEG ou PEO vise à améliorer ses propriétés et comportements au niveau moléculaire, dans l’organisme, ou dans une technique (analyse, purification, matériaux). Typiquement, on peut constater :

  • une solubilité et/ou hydrosolubilité améliorées
  • des effets stériques et hydrodynamiques (interactions moléculaires améliorées en milieux aqueux),
  • un effet espaceur (longueurs ajustables)
  • une non toxicité, faible immunogénicité, biodisponibilité améliorée…
  • une compatibilité avec toutes les chimies de couplage/marquage/fonctionnalisation

2/ Des caractéristiques, propriétés et applications aux déclinaisons multiples

Les agents de PEGylation sont polaires, donc solubles en solutions aqueuses ce qui les rend adaptés aux applications biologiques/biochimiques. Des concentrations supérieures sont réalisables lors de l’étape de couplage, autorisant des taux de couplage supérieurs.

Plus intéressant, l’hydrosolubilité est portée par le bras espaceur (et non par la fonction réactive des agents sulfonés (aussi polaires), qui est éliminée, donc l’hydrophilie est conférée au conjugué. Ce qui a pour implication les élements ci-dessous :

  • Les chaines hydrophiles favorisent la solubilité des conjugués en tampons aqueux, ce qui réduit l’agrégation parfois observée avec des conjugués formés par des crosslinkers classiques. Cela évite aussi des précipitations donc augmente la stabilité du conjugué.
  • L’hydrophilicité d’un médicament pegylé change sa distribution entre les compartiments dans l’organisme : il sera en général moins séquestré dans les compartiments gras et plus biodisponible. La mobilité est augmentée en solution aqueuse, modifiant en général favorablement l’interaction d’un médicament ou sonde affine vis-à-vis de sa cible (enzyme, récepteur sur une paroi biologique…).
  • Les poids et tailles moléculaires du conjugué sont augmentés, et modulables en fonction de la longueur de la chaine PEO/PEG. De petits PEG greffés peuvent rendre hydrosoluble avec une augmentation limitée de taille. Au contraire un médicament pegylé par de grands PEG ne sera plus filtré par les reins.
  • Le volume stérique, notamment hydrodynamique, est aussi accru. Cela permet de protéger bioactif contre une activité proteolytique, changer les propriétés de surface d’un support et ses interactions avec des solutés ou d’autres supports (effet anti agrégeant pour des particules). Ainsi, des propriétés macromoléculaires très intéressantes apparaissent (ex : capacité d’absorbtion et viscosité d’hydrogels ; séquestration/relargage d’agents actifs ; amphipilicité de polymères alternant des motifs hydrophiles et hydrophobes, CMC et nombre d’agrégation de micelles).
  • Les agents de PEGylation peuvent être ramifiés, ce qui permet de créer des structures originales (ex. dendrons) en solution ou immobilisées. La PEGylation crée alors des propriétés singulières au niveau physique (de par la stéricité), chimique voire biochimique (de par la multivalence).
  • Les agents de PEGylation sont proposés fonctionnalisés par des groupes utilisés en chimies classiques (NHS/Amine, Maléimide/Sulfhydrile,…) et modernes (chimies click). Il est alors possible de greffer des marqueurs (fluorophore, tag,…), des groupes affins, substrat, antigènes, oligos ou peptides, de facon bioorthogonale (sans interférer avec les composés biologiques / in vivo). La conjugaison peut associer plusieurs mêmes fonctions, ou des différentes qui se combinent ou interfèrent dans le polymère ou avec des partenaires (AntibodyDrugConjugate, affinité + substrat, fixation bispécifique, FRET, molecular beacons,…). Les constructions sont infinies, disposant ces fonctions linéairement ou non sur le PEG (ou à l’inverse: peptides multi-PEGylé), régulièrement (polymères) ou non…

3/ Les applications de la PEGylation sont très nombreuses :

  • synthèse organique,PEGylation application
  • biochimie,      
  • analyse,
  • purification,                  
  • fonctionnalisation de surface,
  • sciences des matériaux (bio-, nano-),
  • hydrogels,       
  • culture cellulaire,        
  • proteomics,
  • genomics

 

Comparaison de l’uricase et la PEG-uricase

Fig : Comparaison de l’uricase et la PEG-uricase La PEG-uricase comporte 40 polymères de PEG 10kDa.

La PEGylation :

  • accroit la solubilité au pH physiologique,
  • accroit la demi-vie dans le serum, 
  • réduit l’immunogenicité sans compromettre l’activité biologique.

 

PEGylation PEO versus PEG :

Les agents de PEGylation sont comparaison_PEG_PEO_pegylation_interchim_blog_0916obtenus en général par polymérisation et purification.
Ils présentent alors une certaine dispersion de taille/poids (MW), typiquement Gaussienne avec un index de dispersion (PDI) de 1.05 à 1.2 ce qui fait plus de 30 (voire 100) composés différents.
Cette dispersion, même au plus faible (~1%: pour les PEG dits ‘monodisperses’, ‘homogènes’, de 100 à 1250Da), génère une variabilité des conjugués souvent néfaste.
Il est rarement proposé des PEG parfaitement définis au niveau moléculaire (qualifiés de ‘discrets’ ou plus proprement ‘composé unique’).

PEG_PEO_Pegylation_interchim_blog_0916

Analyse HPLC de PEG discrets (PEO) et polydisperses (PEG): Le PEO est un produit mono-signal (composé unique), le PEG polydisperse n’est pas homogene (>14 composés)

Pour éviter l’ambiguïté des appellations, Interchim qualifie :
– ‘PEO’ ces derniers ‘single compounds’, d’origine synthétique (tailles jusqu’à 2KD, voire 8KDa);
– ‘PEG’ les composés classiques poly- et pauci- voir mono-disperses (de 0.1 à 300KD).

 

Chimies de PEGylation :

Chimie PEGylationLa PEGylation covalente utilise des crosslinkers à bras espaceur PEG ou PEO terminés par des groupes fonctionnels variés, en chimies de couplage classique (NHS/MAL, EDC,…) ou par chimies click (Azide, Alkyne, DBCO, CHO, 4FB, HyNic, AminoOxy…).

Ces dernières chimies, dites bioorthogonales (n’interférant pas avec les composés biologiques), présentent une spécificité et orientation du couplage chimique, tout en restant plus flexible et contrôlable (voir l’article ‘Chimies click et marquage métabolique’).

 

Retrouvez nos agents de PEGylation directement sur notre site, en cliquant ici ou en cliquant sur les propositions ci-dessous :

Type/espaceur :

  • PEG  (160-950Da à 1-300KD)
  • PEO (2 à 48)
  • Branché (multi-bras): arm (2 à 9 )

Groupes fonctionnels :





Float-A-Lyser : Les dispositifs prêt-à-l’emploi de dialyse


Float-A-Lyser : le dispositif de dialyse prêt à l’emploi – 250 µl à 10 000 µl

Float_A_Lyser_Spectrum_interchim_blog_0616Les systèmes Float-A-Lyser sont destinés aux dialyses d’échantillons de 500 µl à 10 ml dans une gamme de seuils de coupures 500 Da à 1 000 000 Da.
L’utilisation d’un Float-A-Lyzer est simple, il suffit de le rincer à l’eau , charger l’échantillon avec une pipette et le mettre à flotter dans le bain de dialyse. Ensuite, il ne reste qu’à ouvrir le bouchon et pipeter !
En plus d’être facile à utiliser, le Float-A-Lyzer garantit une récupération d’échantillon de 95-98 % tout en gardant une pureté de 99 % avec une dilution <1%.

 

 

Les Float-A-Lyzer G2 augmentent l’efficacité et la praticité des dialyses :

– Les membranes de haute qualité assurent une haute hemi-perméabilité très sélective selon le poids moléculaire, avec une faible absorption protéiques, une excellente pureté, et prévient des contaminations d’échantillons.
– Comparé aux systèmes de dialyse à cassette, la configuration en tube évite la dilution de l’échantillon (moins d’effet d’osmose) et permet une agitation plus efficace du tampon à l’extérieur et de l’échantillon dans le tube. De plus, en utilisant l’absorbant SpectraGet, l’échantillon peut être plus concentré.
– L’injection de l’échantillon dans le Float-A-Lyzer ne nécessite pas d’accessoires spécifiques, de même pour sa récupération : des pipettes et embouts ordinaires suffisent. Le bouchon vissant anti-fuite, permet un accès aisé et répétable autorisant des ponctions durant la dialyse en évitant les risques de crevaison par aiguille. Le flotteur inclu permet au dispositif de flotter tout seul bien orienté verticalement.

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Caractéristiques :
– 3 tailles d’échantillon (volumes maxi de 1ml, 5ml ou 10ml)
– 6 seuls de coupure (100-500 Daltons, 3,5-5 kDa, 8-10 kDa, 20 kDa, 50 kDa et 100 kDa)
– Membrane : ultra-pure Biotech Cellulose Ester (CE) 

Micro Float-A-Lyzer ® prêt à l’emploi


– Avec le dispositif Micro Float-A-Lyzer ®  la MicroFloat_A_Lyser_interchim_blog_0616dialyse des petits volumes (100-500µ) n’a jamais été aussi facile. La dialyse est assurée par une membrane en Cellulose Ester (CE) Grade Ultrapure Biotech disponible en 7 seuils de coupure de 100 à 100 000 Daltons.
Conçu pour la facilité et la praticité d’emploi : Le Micro Float-A-Lazer reste bien vertical et stable dans le bécher pendant la dialyse (flotteur intégré). Le bouchon Luer-Lok® anti-fuite permet un accès facile avec la seringue fournie pour charger et récupérer l’échantillon – pas besoin d’aiguille ! Plusieurs dispositifs peuvent s’assembler pour la dialyse simultanée de plusieurs échantillons.
Récupération de l’échantillon et pureté : La membrane Biotech Grade CE est synthétique, avec une adsorption protéique faible, disponible en 7 seuils de coupure différents. Elle ne nécessite pas de prétraitement ou de lavage puisqu’elle ne contient que de très peu de contaminant métalliques ou disulfides. La structure tubulaire garantie une surface de contact maximale pour la dialyse et la récupération de 95-98% de l’échantillon en maintenant une pureté de 98%. De plus, en utilisant l’absorbant SpectraGel, l’échantillon peut être concentré.

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Caractéristiques :

–  Verrou en PP :

  • S’ouvre et se ferme pour introduire l’échantillon
  • Code couleur pour identifier le seuil de coupure
  • Etanche et réutilisable

–  Corps :

  • Ferme les hauts et bas des colonnes 
  • Flotte
  • Polycarbonate

 

– Membrane : Ultra-pure, 2 volumes différents
– Isolant : Polyurethane
– Changement de l’échantillon : Seringue de 1ml (incluse)

 

En savoir plus :

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