Nano-Anticorps, de nouveaux outils pour l’analyse des protéines, les immunoessais et la thérapie médicamenteuse


Un peu d’histoire

Camel

A la fin des années 80, au cours de travaux pratiques d’extraction d’immunoglobulines, deux étudiants utilisèrent des échantillons de sérums de dromadaires congelés à la place d’échantillons humains qu’ils craignaient être contaminés par le VIH. Quelle ne fût pas leur surprise de visualiser en plus des habituelles immunoglobulines un groupe d’anticorps plus petits qui ne correspondait à rien de connu.

Ne croyant pas un des anticorps variants ou dégradés mais à des anticorps à part entière, deux chercheurs entreprirent de les caractériser. Ils mirent au jour des anticorps dépourvus de chaîne légère et possédant un seul domaine de reconnaissance antigénique, constituant une nouvelle classe, car mis en évidence chez d’autres espèces de camélidés dont les Lamas et les Alpagas.

 

Structure des Nanocorps

Les anticorps de camélidés sont appelés nanocorps (de l’anglais Nanobody), ou anticorps à chaîne lourde (hcAb). En effet, ils sont très petits, car composés d’une seule chaîne lourde. Ils sont dépourvus de chaîne légère ce qui implique que le fragment Fab (fragment antigen binding) de ces anticorps est réduit à un seul domaine variable (VHH : domaine variable des anticorps à chaîne lourde). Ils ne pèsent qu’environ 15 kDa et n’occupent que 4 nm de long et 2.5 nm de large, bien moins que les anticorps conventionnels (150-175KDa) et leurs fragments, Fab (~50 kDa) et scFv (~25 kDa) !

Structure des Nanocorps

Avantages des Nanocorps

La plupart des avantages résultent de leur petite taille :

  • Ces nanocorps sont capables d’atteindre des épitopes cryptiques des cibles, souvent inaccessibles aux anticorps traditionnels 10x plus gros.
  • La stabilité thermique et chimique des nanocorps est bien meilleure que celle des anticorps traditionnels. La solubilité est aussi améliorée. Ce qui permet leur emploi en conditions extrèmes, et de les délivrer in vivo par voie orale et peut-être oculaire, en plus de l’injection intraveineuse et sous-cutanée.
  • Les nanocorps peuvent également être facilement conjugués, par ex avec des agents tueurs de cellules ou des fluorophores.
  • Injectés in vivo, le nanocorps présente une pharmacocinétique très favorable notamment pour l’imaging (élimination rapide par les reins).
  • Dernier point, mais non le moindre, les nanocorps sont beaucoup plus faciles à produire à partir d’une variété d’hôtes (par génie génétique). Ils peuvent aussi être modifiés (humanisés).

Il a été signalé que par ex in vivo, l’élimination des nanocorps par les reins peut masquer le signal d’une cible proche, ou être trop rapide pour permettre une bonne la fixation du nanocorps sur ses cibles. Le marquage fluorescent peut affecter les propriétés de fixation du nanocorps. Des solutions ont néanmoins aussi été proposées pour limiter ces inconvénients.

 

Nanocorps recombinants, des outils avérés et d’avenir prometteur

Les nanocorps peuvent être beaucoup plus que de simples réactifs. Leur obtention par des techniques génétiques et d’expression phagique permet de les cloner, de les sélectionner (phage collections) et de les façonner (constructions), pour optimiser leur affinité, spécificité, solubilité (mutation aa dans le FR2), et aussi de les fonctionnaliser (humanisation, vectorisation, …). Les applications se diversifient, et le futur s’annonce prometteur du diagnostic au thérapeutique. Vous trouverez ci-dessous quelques exemples de leurs utilisations.

Intérêt en recherche : en imagerie, pour l’étude des fonctions des protéines

En 2006 une équipe de chercheurs a, en créant une nouvelle construction appelée « chromobodies » ( nanocorps liés à des protéines fluorescentes), pu suivre en temps réel les cibles intracellulaires endogènes dans les cellules vivantes. Ainsi, grâce à ces constructions, les biologistes peuvent observer de façon dynamique en temps réel les actions de leur protéine d’intérêt.

Les applications, en recherche et à terme en diagnostic, sont bien plus larges : le nanocorps ainsi produits combinés à une protéine fluorescence (gfp) constitue des sondes de petite taille très utile en imagerie moléculaire (notamment SPECT et PET), et en screening.

Les nanocorps ciblant des antigènes intracellulaires (cytosoliques) ont un potentiel particulier en biologie moléculaire de la cellule, et à terme pour identifier de nouvelles cibles diagnostiques ou thérapeutiques : pour étudier l’expression des protéines, ils permettent une imagerie à haute résolution que ne permettent pas les techniques de silencing (down regulation) ou knock-down (Van Audenhove et al., 2014). Ils permettent de mieux corréler la localisation et la fonction des protéines étudiées, jusqu’à l’étude d’interactions protéine-protéines (avec des nanocorps reconnaissant la GFP). Les conditions de pénétration membranaire, et par ex de la barrière hémato-céphalique, restent à investiguer.
L’utilisation de nanocorps a permis l’identification de nouveaux biomarqueurs tumoraux comme par exemple les biomarqueurs de tumeur cérébrale TRIM28 et beta-actin identifiés après analyse en spectrométrie de masse, de complexes nanocorps-antigènes issus d’échantillons de glioblastome multiforme (GMB) (Jovcevska et al., 2014).

Enfin, les nanocorps peuvent améliorer les immuno-tests (Pab, Mab), de par leur haute spécificité, leur stabilité supérieurs, et leur meilleure cinétique. Ils se prêtent aussi aux tests cellulaires ainsi qu’aux immunoPCR.
Leur stabilité a été mise à profit dans des processus requérant des conditions extrêmes de température, de pH ou de force ionique comme le biomarqueur AFP (l’alpha-foetoprotéine) (Chen et al., 2016).

 

Intérêt en immunodiagnostique et thérapeutique

Plusieurs avantages des nanocorps décrits ci dessus en R&D s’appliquent en particulier à l’immunodiagnostique (spécificité, stabilité). Ils peuvent être marqués par des chélates et radioéléments (pour du RIA) ou des fluorophores (pour de la microscopie, de la cytométrie ou du microresau, mais aussi de l’imagerie par scintigraphie, optique, ou par ultrasons). Ainsi, la limite de détection du dosage de l’AFP, biomarqueur de nombreux cancers) passe de 1µg/ml à 0.47ng/ml lorsque des nanocorps anti-AFP sont utilisés (Patris et al., 2014), cette limite peut descendre à 0.0005ng/ ml en immuno-PCR (Chen et al., 2016).

De nombreux projets utilisant des nanocorps sont déjà engagés dans le domaine thérapeutique, comme agent neutralisant d’enzyme ou récepteur, ou comme vecteur d’agent toxique (radioélément, toxine) ou d’agent bioactif (médicament) ciblé sur un organe cible (par ex cancéreux). En octobre 2017, l’entreprise pharmaceutique Ablynx a annoncé des résultats positifs pour son produit de première intention, le caplacizumab, un médicament à base de nanocorps et nanoparticule, issu d’un essai de phase III sur le purpura thrombocytopénique thrombotique acquis (aTTP). Un avantage particulier des nanocorps comparés aux monoclonaux, est de mieux pénétrer les tumeurs, et à terme les cellules (intracorps : voir tableau suivant).

 

Etat de l’art : applications et avancées utilisant les nanocorps

Le tableau ci-dessous est une vue d’ensemble des applications basées sur l’utilisation des nanocorps, leurs avantages et leurs inconvénients lorsqu’ils sont appliqués en tant que produits thérapeutiques, molécules de libération de médicaments, intracorps, outils de diagnostic et/ou d’imagerie, ainsi que les voies de développements actuels.

Nanocorps contre les cibles extracellulaires

Construction :Avantages :
Récepteurs comme cible
EGFR, HER2, c-MET, VEGFR, DR5, CXCR4 / 7
Ligands comme cible
HGF, VEGF, uPA, CXCL11 / 12
Blocs de construction de domaine excellents
Accumulation profonde et homogène dans les tumeurs
Nouveaux épitopes cibles
Limitations :Solutions :
Faible affinité
Elimination rapide dans le sang
Manque d’un fragment Fc Immunogénicité
Constructions multivalentes de nanocorps
Fusion à des nanocorps anti albumine
Addition d’une queue Fc
Humanization
Statut actuel : 
In vitro +++
In vivo:
Xenogreffes ++
Essais cliniques +
Potentiel Thérapeutique

 

Nanocorps pour la libération de médicaments

Construction :Avantages :
Cibles :
VEGFR2, EGFR, c-MET, HER2, MUC1
Libération de toxines
Pseudomonas exotoxin A
Particules de libération
Liposomes, micelles, NANAPs,
polymersomes, polyplexes
Convient pour la conjugaison
Pas de queue Fc
Accumulation tumorale rapide
Peut agir lui-même antagoniste
Limitations :Solutions :
Faible solubilité et / ou stabilité des médicaments
Elimination sanguine rapide affectant principalement la cellule en croissance ou en prolifération
Encapsulation dans des nanoparticules
PEGylation
Viser l’effet de la mort cellulaire
Statut actuel : 
In vitro +++
In vivo :
Xenogreffes ++
Essais cliniques /
Potentiel Thérapeutique

 

Étude fonctionnelle des protéines intracellulaires (intracorps)

Construction :Avantages :
Cibles :
intracellulaires Fascine, cortactine, CapG β caténine, PKCε Vimentine, GFP
Stabilité et activité intracellulaire
Modulation spécifique du domaine/fonction
Facile à fusionner : Aide à la découverte de médicaments
Limitations :Solutions :
Pénétration de la membrane cellulaire requise pour l’usage thérapeutiqueUtilisation d’E.coli enteropathogenic (EPEC)
Nanocorps pénétrant spontanément
Statut actuel : 
In vitro +++
In vivo :
Xenogreffes ++
Applicable pour la recherche en biologie cellulaire

 

Outils de diagnostic (marqueurs du cancer)

Construction :Avantages :
Cibles de biomarqueurs extracellulaires
AFP, CAIX, PMSA
TAG-72, HER2
Grande stabilité
Facile à conjuguer Convient dans plusieurs applications: ELISA, PCR, IHC
Petite taille, propice pour le format puce
Révéler de nouveaux biomarqueurs intracellulaires en IHC
Limitations :Solutions :
Performance accrue souhaitéeSpécifique de l’application
Utiliser un mélange de nanocorps
Statut actuel : 
In vitro +++Applicable pour le diagnostic

 

Imagerie moléculaire

Construction :Avantages :
Cibles
PMSA, MMR, HER2, HGF, VCAM1, CAIX, EGFR
Marqueur
99mTc, 177Lu, 111In, 123I, 68Ga, 89Zr, 124I, 131I
Micro/nanobulles
IRDye800CW, IRDye700DX
Accumulation dans la tumeur rapide et homogène
Elimination sanguine rapide
Conjugaison facile
Imagerie précoce, procédure sûre
Combinaison imagerie et thérapie possible
La chirurgie guidée par l’image devient possible
Limitations :Solutions :
Accumulation dans les reins
Accumulation dans le foie et la rate
Accumulation dans le foie et les intestins
Supprimer l’His-tag
Co-injecter de la gelofusine et / ou de la lysine
Changer d’agent chélateur
Construction spécifique de nanocorps à administrer non marqué
Statut actuel : 
In vitro +++
In vivo :
Xénogreffes +++
Modèles de souris in vivo +++
Essais cliniques + (réussi)
Applicable pour l’imagerie
Potentiel à identifier de nouvelles cibles thérapeutique

D’après I. Van Audenhove, J. Gettemans / EBioMedicine 8 (2016) 40–48

 

Des anticorps de lama comme outils pour la R&D

LamaLes Nanocorps sont utilisés pour leur réaction spécifique sur les antigènes cibles, dans divers immunoassays, imagerie cellulaire et de l’immuno-targetting.

La partie Fc (heavy chain – non spécifique) est utilisée comme un tag (marqueur) que l’on fusionne à une protéine (recombinante) par fusion génétique. Ces LamaFc-Protéines servent d’immunogènes (pour de l’immunisation), et peuvent aussi servir comme antigène marqué dans divers immunoassays (en coating, ou en utilisant des anticorps secondaires -anti Ig de Lama-).

Toujours à l’écoute de la recherche, Interchim® offre désormais des protéines recombinantes liées à des nanocorps de Lama. La plupart de ces protéines sont des cibles thérapeutiques pour la recherche actuelle et future.
Des immunoréactifs issus des hcAbs de Lama sont aussi proposés.

 

En savoir plus :

2 commentaires pour “Nano-Anticorps, de nouveaux outils pour l’analyse des protéines, les immunoessais et la thérapie médicamenteuse”

  1. Bonjour,

    Je vous contacte car étant étudiant en 3ème année de licence de biotechnologie et dans le cadre d’un projet innovant, j’en suis arrivé à entendre parler de ces nanocorps.

    Je voulais donc mieux comprendre comment on rend ces Nanocorps immunogènes (grâce à une protéine fusion). Car en fait dans le cadre de ce projet innovant, je dois détecter une molécule en particulier, qui est de type organique.
    Et je me demandais donc si cela était possible avec ce type d’Anticorps, et quel serait son seuil de détection ?

    Cordialement

    BONNET Aloïs

  2. Merci pour votre interet à cet article.
    Le VHH améliore l’immunogènicité de la protéine à laquelle il a été attachée car il peut favoriser la dimérisation des protéines. Il ne s’agit pas de »rendre les nanocorps immunogènes par la protéine de fusion’.
    Mais son première intérêt est de servir de tag (marqueur) quand on utilise la protéine taggée dans des immunoassays.
    Si vous devez détecter ‘une molécule organique’ (justement… serait-ce une protéine de fusion?), la biosynthèse de votre protéine taggée vhh est un moyen de la détecter.
    Voir la notice technique http://www.interchim.fr/ft/B/BB255l.pdf pour plus d’information, et les réactifs que nous proposons.
    Il existe d’autres tags, ex les protéines biotinylées: voir celles présentes dans la meme brochure,
    et incluables par bioingénierie génétique les ‘GFP/YFP/RFP (Green Fluorescent protein) que nous proposons en vecteurs, ainsi que l’aquaporine/luciferase/luciferine (ici PH-BB213a)
    mais aussi la SEAP et enfin plus classique la polyHis (PH-BB215|h).
    Nous restons à votre disposition.
    L’équipe Interchim


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