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Analysez les nitrosamines dans les médicaments contre l’hypertension (retrait d’un grand nombre de lots)


1. Les nitrosamines dans le viseur des agences de médicaments

Les agences des médicaments françaises, américaines, …, ont demandé le retrait d’un grand nombre de lots de médicaments à base de Sartan, suite à la présence éventuelle d’une impureté.
N-Nitrosodimethylamine (NDMA)En effet, l’impureté incriminée est la N-Nitrosodiméthylamine (NDMA).  Cette substance est classée comme « probablement cancérogène » chez l’homme.
Les nitrosamines peuvent être générées lors de réactions chimiques utilisées pour la fabrication des inhibiteurs des récepteurs de l’Angiotensine II (Sartan).

2. L’application proposée par la FDA pour l’analyse de l’impureté N-Nitrosodiméthylamine (NDMA)

Logo FDALa FDA (Food and Drug Administration) a diffusé une application qui recommande l’utilisation d’une colonne GC polaire DB-WAX UI fabriquée par notre partenaire Agilent pour mener à bien les analyses de N-Nitrosodiméthylamine (NDMA). Pour information, cette application que vous pourrez télécharger plus bas nécessite également l’utilisation d’un passeur automatique Head Space et d’un détecteur GC/MS.

3. Présentation de la colonne GC d’Agilent recommandée et ses avantages indéniables :

Colonne Agilent DB-WAX UIA l’instar des colonnes GC de la même gamme, la colonne DB-WAX UI utilisée pour l’analyse de la molécule N-Nitrosodiméthylamine dans l’application de la FDA offre une excellente inertie avec une forme de pic plus fiable et une meilleure durée de vie que les colonnes WAX concurrentes.
 
Cette gamme de colonnes innovantes présente d’autres avantages remarquables, tels que :

•Passer moins de temps à résoudre les anomalies et à refaire les analyses :

Les colonnes GC DB-WAX UI offrent une forme de pic et une reproductibilité excellente, des limites de détection plus basses et une meilleure stabilité des temps de rétention.

•Économiser de l’argent sur les colonnes :

La durée de vie élevée de l’inertie permet une meilleure résistance à des cycles thermiques répétés.

•Arrêter de préqualifier les colonnes :

Des tests d’inertie spécifiques garantissent une performance immédiate pour toute colonne GC DB-WAX UI.

•Mettre en œuvre rapidement :

Les colonnes GC DB-WAX UI ont la même sélectivité que les colonnes GC Agilent J&W DB-WAX. Ce qui veut dire que vous pouvez facilement passer à la performance Ultra Inert sans recréer les bibliothèques de composés existantes.

Performance DB-WAX UI

Excellente inertie, même après 50 heures d’exposition à 250 °C :

Le mélange test QC DB-WAX Ultra Inert contient des composés tels que du décane, de l’acide propionique, de l’acide 2-éthylhexanoïque et de l’éthyle maltol – pour assurer une inertie constante lors de vos analyses de composés polaires les plus exigeantes.

 

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Comment développer et optimiser une méthode SPE (Extraction sur Phase Solide)


Pour développer une méthode SPE robuste, reproductible et répétable, il est fondamental de choisir au mieux :

  • Le type d’adsorbant (silices ou polymères)
  • La nature de l’adsorbant
  • La masse d’adsorbant
  • Le volume du contenant

Ces quatre paramètres sont essentiels pour obtenir :

  • Une sélectivité de purification intrinsèque à l’échantillon
  • Une capacité de charge nécessaire et suffisante
  • Un facteur de pré-concentration important
  • Un rendement d’extraction optimum

Mettre en œuvre une purification SPE nécessite un minimum de connaissances sur la matrice, les impuretés, les analytes à extraire qui seront par la suite analysés. Les kits de développement de méthodes sont des outils performants et pertinents qui permettent d’apprécier rapidement le type d’adsorbant à utiliser ainsi que la sélectivité qu’il apporte pour réaliser vos extractions.
Pour plus d’informations, notre service s’engage à vous apporter le meilleur support ainsi que des solutions individualisées.

 

Protocole indicatif pour le développement de méthodes SPE sur Polymère

Protocole indicatif pour le développement de méthodes SPE sur Polymère

*Pré-traitement de l’échantillon (Soxhlet, Extraction Lig/Liq (LLE), Extraction Liquide/Solide (SLE), Filtration, Précipitation de protéines…)

Pré-traitement de l’échantillon :

Différents protocoles peuvent être nécessaires avant de déposer l’échantillon sur une colonne SPE (filtration, extraction Liquide/Liquide, extraction avec un appareillage de type Soxhlet). Ces étapes dépendent de la nature de l’échantillon (principalement solide ou liquide).


Conditionnement  :

On utilise principalement des solvants organiques de type Methanol, Acétonitrile, Dichlorométhane. Pour les échantillons aqueux, une deuxième étape de conditionnement avec de l’eau peut s’avérer nécessaire.


Dépôt de l’échantillon.

Lavage :

Le lavage élimine les composés interférents de la matrice qui auraient une légère affinité avec la phase stationnaire de la colonne SPE.

  • Un lavage légèrement acide élimine les acides faibles présents dans le milieu.
  • Un lavage légèrement basique élimine les bases faibles présentes dans le milieu.


Elution :

Les composés d’intérêt sont désorbés de la phase stationnaire.

  • Un solvant organique (Methanol, Acétonitrile, Dichlorométhane) est généralement utilisé pour l’élution des composés par ordre de polarité décroissante (ici phase inverse).
  • En échange d’ions il faut se placer à un pH correspondant à la zone dans laquelle l’analyte est sous forme neutre.

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Extraction sur phase solide : la méthodologie à suivre pour réussir vos préparations d’échantillons


A. Introduction à l’extraction sur phase solide (SPE)

Partie intégrante d’une analyse, la préparation d’échantillons a considérablement évolué ces dernières années. C’est sans aucun doute l’étape la plus importante du processus analytique. Certaines études montrent que la préparation d’échantillons représente en général environ 60% du temps de travail d’un technicien de laboratoire et qu’elle est l’une des principales sources d’erreurs entachant le résultat de l’analyse. Avec ce constat, on comprend mieux pourquoi une bonne préparation d’échantillons influe directement sur la limite de détection, la reproductibilité et la répétabilité de l’analyse. Son impact sur la qualité de l’analyse est fondamental.

La multitude de matrices à traiter (sang, plasma, eaux, organes, viandes, poissons, légumes,…) nécessitent l’emploi de techniques variées : filtration, dialyse, extraction liquide – liquide, extraction sur phase solide (SPE). Parmi celles-ci, l’extraction en phase solide est certainement la technique qui a le plus évolué dans la dernière décennie. Elle est aujourd’hui présente dans la plupart des laboratoires et permet de réaliser des purifications et une concentration efficaces de l’échantillon avant l’analyse HPLC, HPLC/MS, GC ou GC/MS. Le niveau de qualité requis pour les produits de SPE s’est donc renforcé. Ainsi, de nouvelles innovations technologiques telles que les polymères à hautes surfaces spécifiques, les polymères échange d’ions et les silices sphériques pures sont devenues incontournables.

Rendement, capacité, sélectivité, reproductibilité sont les principales vertus qu’attendent les analystes de leurs méthodes de traitement d’échantillon. Grâce à leur expérience, nos laboratoires ont développé la marque Upti-Clean®, supports silices sphériques purs ainsi que les marques Atoll™, PolyClean™ et BioP™, polymères sphériques ultrapurs.
Ces gammes de produits répondent parfaitement aux besoins des méhodes modernes et concourent à les rendre plus fiables, plus reproductibles et plus robustes.

Technical Tip
  • Vérifier la miscibilité des solvants qui seront utilisés
  • Toujours laisser le niveau du solvant au dessus de l’adsorbant pour maintenir son activation.
  • Pour des silices greffées avec un échangeur d’ions, activer avec du méthanol, de l’eau puis avec de l’eau tamponnée au pH souhaité.

 

B. Méthodologie générale SPE

Tous les adsorbants remplis dans des cartouches, colonnes ou plaques 96 puits sont à usage unique (exceptées les colonnes de trapping « on-line » montées en ligne sur un système HPLC). L’utilisation d’appareil est recommandée pour la percolation des différents solvants (appareil à vide, appareil à pression positive, seringues).

Le choix de la colonne est défini par le volume de l’échantillon, sa concentration en analytes et les types d’échanges recherchés. Dans l’environnement, des volumes de plusieurs centaines de millilitres peuvent être nécessaires pour une bonne pré-concentration (ex. : polluants organiques). En revanche, dans l’industrie pharmaceutique, le volume des échantillons à purifier n’est que de quelques millilitres. L’adsorbant choisi doit avoir une excellente affinité pour les composés cibles. Il doit également présenter un minimum d’affinité avec les interférents de la matrice.
Un protocole SPE se décompose en plusieurs étapes.

1. Conditionnement puis Equilibration

Conditionnement puis EquilibrationÉtape d’activation avec un solvant organique ou un mélange de solvants pour permettre l’élimination des contaminants et favoriser les échanges dans l’adsorbant. Cette étape permet également une meilleure mouillabilité des frittés.

L’hexane, le cyclohexane ou le dichlorométhane sont des solvants régulièrement utilisés en mode « phase normale » pour conditionner la silice vierge ou la silice greffée aminopropyle (R-NH2), dihydroxypropyle (R-R’OH-R »OH), cyanopropyle (R-CN), …
En mode « phase inverse », pour des silices greffées C18, C8, C2, phényle, cyclohexyle, on emploie couramment le méthanol voire l’acétonitrile.

2. Introduction de l’échantillon

SPE-Introduction de l'échantillon

L’échantillon est déposé sur la partie supérieure du lit de l’adsorbant. Les impuretés n’ayant aucune affinité avec l’adsorbant ne sont pas retenues. D’autres le sont plus ou moins fortement que les composés d’intérêts. Pour apporter un maximum d’efficacité à la purification, la vitesse d’écoulement de l’échantillon doit être contrôlée.


Les valeurs expérimentales des débits observés pour des granulométries d’approximativement 50 µm sont comprises entre :

  • 0,7 – 1 mL / min pour des colonnes de 1 mL
  • 2 – 3 mL / min pour des colonnes de 3 mL
  • 5 – 7 mL / min pour des colonnes de 6 mL
  • 7 – 10 mL / min pour des colonnes de 15 mL
  • 10 – 15 mL / min pour des colonnes de 25 mL
  • 0,6 – 1,1 mL / min pour des plaques 96 puits
  • 4 – 5 mL / min pour des cartouches fermées

Lors des premiers essais, il est impératif de vérifier que tous les composés d’intérêts de l’échantillon ont été fixés sur l’adsorbant, ce qui implique d’analyser la fraction de percolation. En échange d’ions, le pH de l’échantillon doit être identique au pH du tampon utilisé lors de l’étape d’activation de l’adsorbant.

La percolation des échantillons visqueux à travers une colonne peut être facilitée en utilisant des adsorbants de 90 à 140 µm. La capacité d’échange et la sélectivité ne sont pas affectées.

3. Lavage > Elimination des produits secondaires

SPE-Lavage > Elimination des produits secondairesÉtape qui permet l’élimination d’impuretés possédant moins d’interactions avec l’adsorbant que le ou les composés d’intérêt. D’autres solutions (solvants ou mélanges de solvants) peuvent être utilisées pour une efficacité plus importante. Elles doivent avoir le plus d’affinité possible avec les impuretés et le moins possible avec les composés d’intérêt pour ne pas les éluer à l’issue de cette étape (Attention à la polarité et au pH des solvants de lavage).

4. Séchage > Elimination des traces de solvant de lavage

SPE-Séchage > Elimination des traces de solvant de lavageFaire circuler de l’air pendant 2 à 5 minutes à travers la cartouche pour évaporer les traces de solvant de lavage. Cette étape améliore le rendement d’extraction.

5. Elution > 100% des composés élués par le solvant

SPE-Elution > 100% des composés élués par le solvantÉtape qui consiste à récupérer 100 % des composés d’intérêt présents sur l’adsorbant. Le solvant ou mélange de solvants utilisé doit avoir le maximum d’interactions avec les analytes et le moins possible avec les autres interférents qui peuvent rester adsorbés. Le solvant d’élution doit être le plus efficace possible, son volume doit être faible de manière à obtenir un facteur de pré-concentration très important. Un adsorbant à faible diamètre de particules (ex : 30 ou 50 µm) garantira un volume d’élution plus faible qu’un adsorbant de granulométrie plus grande (ex : 90, 140 µm). Par contre la vitesse d’écoulement des fluides sera plus lente avec un risque potentiel de colmatage pour les échantillons sirupeux.

6. Séchage

Si nécessaire, l’éluat peut être séché avec du sulfate de sodium anhydre pour éliminer les éventuelles traces d’eau.

7. Concentration

Le but de cette étape est de concentrer les composés d’intérêt dans la fraction d’élution. Elle est généralement réalisée par évaporation d’une partie du solvant. Le concentré obtenu est soit directement utilisable, soit repris dans un solvant d’analyse. Une fois optimisées, ces étapes garantissent une analyse plus sensible (augmentation de la concentration des composés d’intérêt), plus reproductible et résolutive (élimination des impuretés qui peuvent modifier la robustesse de l’analyse).

 

C. Définition du « volume lit »

Pour les étapes de conditionnement, de lavage et d’élution, les volumes théoriques sont de 2 à 3 fois le volume de l’adsorbant ou « volume lit » soit :

  • Pour 100 mg de silice 60 A 50 µm : ~120 µL
  • Pour 500 mg de silice 60 A 50 µm : ~ 600 µL
    Pour 100 mg de polymère : ~ 180 µL

SPE-Définition du "volume lit"

Une masse d’adsorbant trop élevée induit une élution incomplète des composés d’intérêt ou une dilution de l’échantillon par un volume d’élution trop important. Une masse d’adsorbant trop faible induit une rétention incomplète des composés d’intérêt que l’on retrouve dans la fraction de percolation ou dans le solvant de lavage. Ces deux situations conduisent à des taux de récupération plus faibles que prévus.

1. Choix de l’adsorbant SPE ?

Quel que soit l’échantillon à purifier (qu’il soit issu de l’environnement, du domaine pharmaceutique, du domaine cosmétique, de l’agrochimie, etc. …), il est fondamental de choisir son adsorbant d’extraction sur phase solide de façon précise.
Le choix de cet adsorbant permettra de définir une sélectivité spécifique aux composés d’intérêt ainsi qu’une capacité de charge suffisante à l’entière adsorption de ceux-ci.

On rencontre en général deux grandes familles :

  • Les silices
  • Les polymères

Ces deux familles possèdent des caractéristiques très différentes.
Leurs applications, avantages et inconvénients sont divers et variés.

2. Polymères

  • Très stables chimiquement, ils résistent le plus souvent à un pH compris entre 1 et 14.
  • Faiblement sélectifs comparés aux silices greffées (exceptés les polymères échange d’ions).
  • Ils possèdent une capacité de charge bien supérieure aux silices traditionnelles et permettent la purification d’un très grand nombre de molécules ou de familles de molécules quelle que soit la matrice (eaux, huiles, plasma, urines, …)

La masse de composés adsorbables peut aller jusqu’à 30% de la masse du polymère contenue dans la colonne. Il est donc possible de réaliser le même travail de purification avec une quantité de polymères 2 à 3 fois moindre que celle d’une silice. Le volume d’élution est beaucoup plus faible, ce qui conduit à une concentration plus importante, une durée de l’évaporation réduite et finalement une préparation d’échantillon plus rapide.

AdsorbantMasse d’adsorbantSurface SpécifiqueCapacité de charge
Silices500 mg500 m2/g5 – 50 mg
Polymères500 mg800 m2/g15 – 100 mg
Polymères500 mg1500 m2/g15 – 150 mg

 

3. Silices

  • Stabilité chimique moins importante que les polymères, elles sont stables à un pH compris entre 2 et 7,5.
  • Beaucoup plus sélectives que les polymères avec une capacité de charge moins importante du fait de leur plus faible surface spécifique (de l’ordre de 3 à 10% de la masse d’adsorbant), les silices restent toujours des adsorbants de référence très utilisés.

On distingue 4 familles de silices identifiables par leur mode de fonctionnement ainsi que par leur sélectivité :

a. Silices pour mode « Phase inverse »

En mode « Phase Inverse », les greffons hydrophobes fonctionnent selon les interactions de type Van der Walls. La purification permet un isolement de familles de composés apolaires ou faiblement polaires.
L’ajout de tampon est préférable lorsque les composés sont ionisables (acides, bases).
Les phases apolaires non post-silanisées (non end capped) donnent, avec les groupements silanols superficiels, des interactions polaires supplémentaires qui peuvent améliorer la rétention des composés contenant des fonctionnalités polaires.
Pour un même éluant, plus la chaîne carbonnée est courte, plus la rétention d’un composé est faible.
Pour les composés aromatiques, le greffage phényl présente de meilleures interactions.
Le méthanol ou l’acétonitrile sont des solvants d’élution régulièrement utilisés.

b. Silices pour mode « Phase Normale »

Le mode « phase normale » reste un compromis très intéressant pour la purification de molécules ou familles de molécules dont la structure présente un grand nombre de fonctions polaires. Le choix du solvant est très important et influe directement sur le type d’interaction mis en oeuvre pour la purification (un solvant apolaire favorise les interactions polaires entre l’adsorbant et les composés).

  • Le greffage cyano (CN) peut être utilisé soit en « phase normale » pour l’extraction de composés polaires soit en « phase inverse » pour les molécules moyennement polaires.
  • La silice greffée Diol se présente comme une très bonne alternative à la silice vierge pour l’extraction de composés polaires (liaisons hydrogène).
  • Phase mixte, la silice amino (NH2) peut s’utiliser comme un échangeur d’anions faible (pour les acides très forts) ou comme un adsorbant polaire qui peut interagir avec les groupements fonctionnels -OH, -NH, -SH-, …

c. Silices pour mode « Echange d’ions »

En mode « échange d’ions », le mécanisme de rétention est l’interaction ionique. L’extrémité du greffon de l’adsorbant crée une attraction forte avec le ou les composés de l’échantillon possédant une ou des fonctions ionisables antagonistes. L’interaction des phases échangeuses d’ions dépend essentiellement du pH et de la force ionique du contre-ion. La force de la liaison sera d’autant plus importante que l’acide et la base qui s’apparient sont forts, ce qui peut être problématique pour l’étape d’élution et pour l’obtention d’un bon taux de recouvrement.

C’est pourquoi il existe différents greffons échange d’ions :

  • Les phases échangeuses d’anions (SAX) sont généralement une amine quaternaire très forte. Elles sont utilisées pour extraire les acides faibles portant une ou des charge(s) négative(s).
  • Les phases échangeuses de cations (SCX) ayant une fonctionnalité sulfonique sont utilisées pour extraire tous les composés basiques faibles portant une ou des charge(s) positive(s).
  • Les phases échangeuses d’anions, (DEAE, DEA, NH2,…) sur une base d’amine moins forte que le SAX, sont utilisées pour extraire les acides forts portant une ou des charge(s) négative(s).
  • Les phases échangeuses de cations (WCX) sont fonctionnalisées par un acide carboxylique et sont utilisées pour extraire tous les composés basiques forts portant une ou des charge(s) positive(s).

d. Silices pour mode « Mixed Mode »

Une des techniques les plus sélectives des adsorbants silices greffées est celle du « mode mixte » ou « mixed mode ». Le double greffage (échange d’ions et chaînes carbonées hydrophobes) apporte de nouvelles sélectivités. Les composés d’intérêt, qui doivent impérativement posséder une fonction acide ou basique, sont retenus sur le greffage échange d’ions. Un premier lavage puissant faisant intervenir le pH permet d’éliminer les impuretés ionisables. Il est ensuite possible d’éliminer les autres impuretés retenues sur le greffage hydrophobe par un solvant organique. Cette technique est très utilisée pour l’extraction de composés basiques (médicaments, drogues et métabolites) dans les fluides biologiques (sang, plasma, urines, …).


Comme en « échange d’ions », il existe différents greffons spécifiques aux composés d’intérêt :
Les phases « mixed mode » (RP/SCX) sont constituées d’un acide fort (sulfonique) et d’un greffon hydrophobe. Elles sont utilisées pour extraire les bases faibles portant une ou des charge(s) négative(s).

  • Les phases « mixed mode » (RP/SAX) sont sur une base d’amine quaternaire et de greffons hydrophobes. Elles sont utilisées pour extraire les acides faibles portant une ou des charge(s) négative(s).
  • Les phases « mixed mode » (RP/WCX) sont constituées d’un acide faible (carboxylique) et de greffons hydrophobes. Elles sont utilisées pour extraire les bases fortes portant une ou des charge(s) négative(s).
  • Les phases « mixed mode » (RP/NH2) sont sur une base d’amine faible et de greffons hydrophobes. Elles sont utilisées pour extraire les acides forts portant une ou des charge(s) négative(s).

SPE-Silices "Mixed Mode"

4. La répartition en fonction du pH de la proportion acide/base conjuguée d’un composé ionisable acide (rouge) et basique (bleu) en solution

SPE-Repartition en Fonction du pH

 

Technical Tip
Les méthodes d’extraction SPE basées sur les modes « Échange d’Ions » et « Mixed Modes » sont relativement complexes à mettre en oeuvre.
Au niveau de l’échantillon, les acides et les bases en solution doivent se présenter sous leurs formes ionisées pour développer des interactions avec l’adsorbant.
Pour rendre reproductibles et répétables les taux de récupération, il est indispensable de tamponner l’échantillon et l’adsorbant au pH optimum.
Ex : Pour la zone de pH comprise entre 5,6 et 8,6 dans l’exemple ci-joint, la totalité des composés acides (pKa 3,6) et basiques (pKa 10,6) s’apparient en formant une liaison ionique forte.

 

5. La sélectivité relative des contre ions

Un contre-ion est une espèce chimique ionique capable de s’apparier sur un échangeur d’ions. En fonction de sa concentration en solution et de son affinité avec l’échangeur, il améliore l’efficacité des étapes de lavages et d’élutions.

SPE-Sélectivité relative des contre ions

En savoir plus :

  • Retrouver nos consommables SPE et notre instrument, le SPE 6.25ws WorkStation sur notre site www.interchim.com
  • Consultez notre article (bientôt disponible) dédié au développement et à l’optimisation de méthode d’extraction sur phase solide.
  • Consultez notre article (bientôt disponible) dédié à notre service de fabrication à façon (colonnes & plaques).
  • N’hésitez pas à nous contacter.
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Analyse directe de protéines avec Advion Touch Express Open port sampling interface (OPSI)


1. Principe de fonctionnement du Touch Express d’Advion

Le Touch express est un nouveau système d’introduction d’échantillon pour l’analyse en spectrométrie de masse utilisant une technique développée par Gary Van Berkel et Vilmos Kertesz du laboratoire national d’Oak Ridge: Open Port Sample Interface (OPSI).

Ce système d’introduction d’échantillon couplé à un spectromètre de masse expression CMS Advion fournit rapidement (en moins de 30 secondes) un résultat à partir d’une surface, d’un solide ou d’un liquide.

Le système OPSI est constitué d’un port ouvert balayé en continu par un solvant envoyé ensuite directement dans la source electrospray (ESI) du spectromètre de masse.

L’analyse est effectuée par simple contact d’un échantillon sur ce port ouvert.

OPSI PALLab

Figure 1 : Touch Express couplé au spectromètre de masse expressionL CMS.
L’analyse est réalisée avec une source ESI en mode positif en utilisant de l’acétonitrile
avec 0,1% d’acide formique comme solvant de make-up à un débit de250µL/min.

 

Menisque du solvant sur port ouvert

Schéma OPSI

1. Solvant make-up pompe (250µL/min)
2. Envoi de l’échantillon vers la source ESI par Effet Venturi

Figure 2 : Fonctionnement de l’OPSI.
Le solvant de make-up est envoyé sur le port ouvert où il forme un ménisque
avant d’être envoyé vers la source d’ionisation sous l’effet Venturi
du gaz de nébulisation.

 

2. Exemple d’application avec leTouch Express OPSI couplé à un spectromètre de masse expressionL CM

Dans l’exemple ci-dessous, le Touch Express OPSI est couplé à un spectromètre de masse expressionL CMS pour démontrer la rapidité d’analyse de protéines : 2µL de myoglobin (cheval) ainsi que 2µL de cytochrome C (cheval) à une concentration de 1mg/mL dans 10mM d’acétate d’ammonium sont déposés directement sur le port avec une pointe de pipette.

Spectre Myoglobin

Figure 3 : analyse de la myoglobine avec le Touch Express OPSI
3a. Spectre de masse de la myoglobine
3b. masse déconvoluée et non chargée de la myoglobin

 

Spectre_Cytochrome

Figure 4 : analyse du cytochrome C avec le Touch Express OPSI
4a. Spectre de masse du cytochrome C
4b. masse déconvoluée et non chargée du cytochrome C

 

Résultats :

Après l’analyse de l’échantillon, une déconvolution de charge est effectuée grâce au logiciel Advion Data Express qui calcule automatiquement la masse de la protéine non chargée à partir du spectre de la biomolécule obtenue. Les spectres de masse et la masse déconvoluée et non chargée de la myoglobine et du cytochrome C sont présentés fig 3 et 4.

Un total de 14 ions de la myoglobin est détecté (fig 3a). La masse non chargée de la myoglobine est de 16 951.2 (fig 3b).
De même pour le cytochrome C un total de 12 ions est détecté. La masse non chargée du cytochrome C est de 12 359.3 (fig 4b).

 

Conclusions :

Le Touch Express OPSI fournit :

  • Une analyse directe par contact de l’échantillon (surface, solide ou liquide)
  • Une analyse rapide < 30s

Le tout sans aucun risque de contamination puisque le port est continuellement rincé par le solvant de make-up.

 

En savoir plus :

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SPE, HPLC et Flash Prep LC : les différences entre ces 3 processus séparatifs


1. Les différences entre SPE, HPLC et Flash Prep LC

SPE (pour Sample prep Extraction)

  • Processus séparatif discontinu
  • Analytes de polarités et structures différentes
  • Echantillons de mélanges complexes dans lesquels se trouvent un grand nombre de solutés parasites perturbant la séparation

LC (pour Liquid Chromatography)

  • Processus séparatif continu
  • Analytes de polarités et structures voisines
  • Solutions injectées relativement propres

LC prep & Flash

  • Processus séparatif continu
  • Analytes de polarités et structures voisines
  • Mélanges à purifier plus ou moins propres
 Chromatographie
(HPLC, prep LC, Flash)
Extraction
(SPE,SLE)
Processus séparatifContinuDiscontinu
Solutés dans la colonneToujours en mouvementBloqués puis décrochés
Composition phase mobileSoit constante (analyse isocratique)
Soit changée continûment (gradient)
Changée pas à pas
Type de séparationChromatographie d’élutionChromatographie frontale
Volume de la colonne occupé:
par les analytes
par la seule phase mobile
1 à 2 % (HPLC)
99-98 %(HPLC)
100 %
0 %
Constituants de l’échantillonSolutés de polarités voisinesSolutés de polarités différentes
UtilisationRéutilisable« One Shot »
Coût de fonctionnementMoyen à élevéFaible
Coût de l’appareillageElevéFaible

 

2. SPE & HPLC > Définitions

SPE

Elle sert à pré-séparer des solutés de structures différentes et à les recueillir dans un minimum de solvant. D’où les longueurs très courtes des cartouches de SPE. Pour que la SPE sépare les solutés d’intérêt, on doit travailler avec des facteurs de sélectivité supérieurs à 4. Le mode step gradient facilite la séparation. La SPE est une chromatographie fonctionnant à très grande sélectivité.

HPLC

Compte tenu de l’efficacité des supports de petit diamètre de particules et des longueurs de colonnes usuelles, on percolera la colonne en continu par la phase mobile et on séparera facilement des solutés avec un facteur de sélectivité de 1,05.
En conclusion, les lois permettant de choisir la phase mobile sont les mêmes en LC et en SPE mais elles seront utilisées selon des critères différents.

 

3. Caractéristiques des phases stationnaires utilisées en HPLC, Flash et SPE

 HPLCFlashSPE
Diamètre des particules1,7 à 10 µm15 – 50 µm30 à 140 µm
Compacité du remplissageForte15 – 50 µmForte
Effets extra colonneFaibles (si optimisés)– – –Forts
Longueur de colonne3 à 30 cm5 à 50 cm~ 1 à 2 cm
Efficacité (Nombre de plateaux)5000 à 60001000- 5000~ 10 à 50
Sélectivité nécessaireFaibleMoyenneForte
Polarité des analytesPeu différentePeu différenteTrès différente
Diamètre des pores60 – 150 Å60 – 150 Å60 – 150 Å
Surface spécifique50 – 450 m2/g50 – 450 m2/g500 – 1500 m2>/g

Réalisée en collaboration avec l’Université Paris-Sud, Pr A. Tchapla & Dr S. Héron, LETIAM, IUT d’Orsay, Orsay, France.

 

4. Influence de la taille des particules

En SPE, le diamètre des particules varie de 30 à 140 μm, les longueurs de lit de 1 à 2 cm.

En HPLC, le diamètre des particules est compris entre 1,7 et 5 μm, les longueurs classiques de colonne entre 5 et 25 cm.

En prep LC et Flash, le diamètre des particules varient de 10 à 50 μm, les longueurs des colonnes de 5 à 50 cm.

Pour une même phase stationnaire, si seul le diamètre de particules diffère (mêmes solutés, même phase mobile, même température) :

  • la rétention et la sélectivité ne seront pas affectées
  • la résolution sera changée (les longueurs des colonnes affectent également le nombre de plateaux).
Efficacité théoriqueØ des particulesApplications
5 000 plateaux/m50 µmFlash purification
SPE
20 000 plateaux/m15 µmFlash purification
SPE
prep LC
33 000 plateaux/m10 µmprep LC
80 000 plateaux/m5 µmAnalytique
130 000 plateaux/m3 µmAnalytique
180 000 plateaux/m2,2 µmAnalytique
UHPLC
220 000 plateaux/m1,7 µmUHPLC

Classiquement une colonne d’HPLC analytique de longueur 25 cm, remplie de particules de 5 µm développe une efficacité de l’ordre de 20 000 plateaux en routine. Une cartouche de SPE de longueur 1,25 cm remplie de particules de 50 µm développe une efficacité de l’ordre de 50 plateaux.

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Nano-Anticorps, de nouveaux outils pour l’analyse des protéines, les immunoessais et la thérapie médicamenteuse


Un peu d’histoire

Camel

A la fin des années 80, au cours de travaux pratiques d’extraction d’immunoglobulines, deux étudiants utilisèrent des échantillons de sérums de dromadaires congelés à la place d’échantillons humains qu’ils craignaient être contaminés par le VIH. Quelle ne fût pas leur surprise de visualiser en plus des habituelles immunoglobulines un groupe d’anticorps plus petits qui ne correspondait à rien de connu.

Ne croyant pas un des anticorps variants ou dégradés mais à des anticorps à part entière, deux chercheurs entreprirent de les caractériser. Ils mirent au jour des anticorps dépourvus de chaîne légère et possédant un seul domaine de reconnaissance antigénique, constituant une nouvelle classe, car mis en évidence chez d’autres espèces de camélidés dont les Lamas et les Alpagas.

 

Structure des Nanocorps

Les anticorps de camélidés sont appelés nanocorps (de l’anglais Nanobody), ou anticorps à chaîne lourde (hcAb). En effet, ils sont très petits, car composés d’une seule chaîne lourde. Ils sont dépourvus de chaîne légère ce qui implique que le fragment Fab (fragment antigen binding) de ces anticorps est réduit à un seul domaine variable (VHH : domaine variable des anticorps à chaîne lourde). Ils ne pèsent qu’environ 15 kDa et n’occupent que 4 nm de long et 2.5 nm de large, bien moins que les anticorps conventionnels (150-175KDa) et leurs fragments, Fab (~50 kDa) et scFv (~25 kDa) !

Structure des Nanocorps

Avantages des Nanocorps

La plupart des avantages résultent de leur petite taille :

  • Ces nanocorps sont capables d’atteindre des épitopes cryptiques des cibles, souvent inaccessibles aux anticorps traditionnels 10x plus gros.
  • La stabilité thermique et chimique des nanocorps est bien meilleure que celle des anticorps traditionnels. La solubilité est aussi améliorée. Ce qui permet leur emploi en conditions extrèmes, et de les délivrer in vivo par voie orale et peut-être oculaire, en plus de l’injection intraveineuse et sous-cutanée.
  • Les nanocorps peuvent également être facilement conjugués, par ex avec des agents tueurs de cellules ou des fluorophores.
  • Injectés in vivo, le nanocorps présente une pharmacocinétique très favorable notamment pour l’imaging (élimination rapide par les reins).
  • Dernier point, mais non le moindre, les nanocorps sont beaucoup plus faciles à produire à partir d’une variété d’hôtes (par génie génétique). Ils peuvent aussi être modifiés (humanisés).

Il a été signalé que par ex in vivo, l’élimination des nanocorps par les reins peut masquer le signal d’une cible proche, ou être trop rapide pour permettre une bonne la fixation du nanocorps sur ses cibles. Le marquage fluorescent peut affecter les propriétés de fixation du nanocorps. Des solutions ont néanmoins aussi été proposées pour limiter ces inconvénients.

 

Nanocorps recombinants, des outils avérés et d’avenir prometteur

Les nanocorps peuvent être beaucoup plus que de simples réactifs. Leur obtention par des techniques génétiques et d’expression phagique permet de les cloner, de les sélectionner (phage collections) et de les façonner (constructions), pour optimiser leur affinité, spécificité, solubilité (mutation aa dans le FR2), et aussi de les fonctionnaliser (humanisation, vectorisation, …). Les applications se diversifient, et le futur s’annonce prometteur du diagnostic au thérapeutique. Vous trouverez ci-dessous quelques exemples de leurs utilisations.

Intérêt en recherche : en imagerie, pour l’étude des fonctions des protéines

En 2006 une équipe de chercheurs a, en créant une nouvelle construction appelée « chromobodies » ( nanocorps liés à des protéines fluorescentes), pu suivre en temps réel les cibles intracellulaires endogènes dans les cellules vivantes. Ainsi, grâce à ces constructions, les biologistes peuvent observer de façon dynamique en temps réel les actions de leur protéine d’intérêt.

Les applications, en recherche et à terme en diagnostic, sont bien plus larges : le nanocorps ainsi produits combinés à une protéine fluorescence (gfp) constitue des sondes de petite taille très utile en imagerie moléculaire (notamment SPECT et PET), et en screening.

Les nanocorps ciblant des antigènes intracellulaires (cytosoliques) ont un potentiel particulier en biologie moléculaire de la cellule, et à terme pour identifier de nouvelles cibles diagnostiques ou thérapeutiques : pour étudier l’expression des protéines, ils permettent une imagerie à haute résolution que ne permettent pas les techniques de silencing (down regulation) ou knock-down (Van Audenhove et al., 2014). Ils permettent de mieux corréler la localisation et la fonction des protéines étudiées, jusqu’à l’étude d’interactions protéine-protéines (avec des nanocorps reconnaissant la GFP). Les conditions de pénétration membranaire, et par ex de la barrière hémato-céphalique, restent à investiguer.
L’utilisation de nanocorps a permis l’identification de nouveaux biomarqueurs tumoraux comme par exemple les biomarqueurs de tumeur cérébrale TRIM28 et beta-actin identifiés après analyse en spectrométrie de masse, de complexes nanocorps-antigènes issus d’échantillons de glioblastome multiforme (GMB) (Jovcevska et al., 2014).

Enfin, les nanocorps peuvent améliorer les immuno-tests (Pab, Mab), de par leur haute spécificité, leur stabilité supérieurs, et leur meilleure cinétique. Ils se prêtent aussi aux tests cellulaires ainsi qu’aux immunoPCR.
Leur stabilité a été mise à profit dans des processus requérant des conditions extrêmes de température, de pH ou de force ionique comme le biomarqueur AFP (l’alpha-foetoprotéine) (Chen et al., 2016).

 

Intérêt en immunodiagnostique et thérapeutique

Plusieurs avantages des nanocorps décrits ci dessus en R&D s’appliquent en particulier à l’immunodiagnostique (spécificité, stabilité). Ils peuvent être marqués par des chélates et radioéléments (pour du RIA) ou des fluorophores (pour de la microscopie, de la cytométrie ou du microresau, mais aussi de l’imagerie par scintigraphie, optique, ou par ultrasons). Ainsi, la limite de détection du dosage de l’AFP, biomarqueur de nombreux cancers) passe de 1µg/ml à 0.47ng/ml lorsque des nanocorps anti-AFP sont utilisés (Patris et al., 2014), cette limite peut descendre à 0.0005ng/ ml en immuno-PCR (Chen et al., 2016).

De nombreux projets utilisant des nanocorps sont déjà engagés dans le domaine thérapeutique, comme agent neutralisant d’enzyme ou récepteur, ou comme vecteur d’agent toxique (radioélément, toxine) ou d’agent bioactif (médicament) ciblé sur un organe cible (par ex cancéreux). En octobre 2017, l’entreprise pharmaceutique Ablynx a annoncé des résultats positifs pour son produit de première intention, le caplacizumab, un médicament à base de nanocorps et nanoparticule, issu d’un essai de phase III sur le purpura thrombocytopénique thrombotique acquis (aTTP). Un avantage particulier des nanocorps comparés aux monoclonaux, est de mieux pénétrer les tumeurs, et à terme les cellules (intracorps : voir tableau suivant).

 

Etat de l’art : applications et avancées utilisant les nanocorps

Le tableau ci-dessous est une vue d’ensemble des applications basées sur l’utilisation des nanocorps, leurs avantages et leurs inconvénients lorsqu’ils sont appliqués en tant que produits thérapeutiques, molécules de libération de médicaments, intracorps, outils de diagnostic et/ou d’imagerie, ainsi que les voies de développements actuels.

Nanocorps contre les cibles extracellulaires

Construction :Avantages :
Récepteurs comme cible
EGFR, HER2, c-MET, VEGFR, DR5, CXCR4 / 7
Ligands comme cible
HGF, VEGF, uPA, CXCL11 / 12
Blocs de construction de domaine excellents
Accumulation profonde et homogène dans les tumeurs
Nouveaux épitopes cibles
Limitations :Solutions :
Faible affinité
Elimination rapide dans le sang
Manque d’un fragment Fc Immunogénicité
Constructions multivalentes de nanocorps
Fusion à des nanocorps anti albumine
Addition d’une queue Fc
Humanization
Statut actuel : 
In vitro +++
In vivo:
Xenogreffes ++
Essais cliniques +
Potentiel Thérapeutique

 

Nanocorps pour la libération de médicaments

Construction :Avantages :
Cibles :
VEGFR2, EGFR, c-MET, HER2, MUC1
Libération de toxines
Pseudomonas exotoxin A
Particules de libération
Liposomes, micelles, NANAPs,
polymersomes, polyplexes
Convient pour la conjugaison
Pas de queue Fc
Accumulation tumorale rapide
Peut agir lui-même antagoniste
Limitations :Solutions :
Faible solubilité et / ou stabilité des médicaments
Elimination sanguine rapide affectant principalement la cellule en croissance ou en prolifération
Encapsulation dans des nanoparticules
PEGylation
Viser l’effet de la mort cellulaire
Statut actuel : 
In vitro +++
In vivo :
Xenogreffes ++
Essais cliniques /
Potentiel Thérapeutique

 

Étude fonctionnelle des protéines intracellulaires (intracorps)

Construction :Avantages :
Cibles :
intracellulaires Fascine, cortactine, CapG β caténine, PKCε Vimentine, GFP
Stabilité et activité intracellulaire
Modulation spécifique du domaine/fonction
Facile à fusionner : Aide à la découverte de médicaments
Limitations :Solutions :
Pénétration de la membrane cellulaire requise pour l’usage thérapeutiqueUtilisation d’E.coli enteropathogenic (EPEC)
Nanocorps pénétrant spontanément
Statut actuel : 
In vitro +++
In vivo :
Xenogreffes ++
Applicable pour la recherche en biologie cellulaire

 

Outils de diagnostic (marqueurs du cancer)

Construction :Avantages :
Cibles de biomarqueurs extracellulaires
AFP, CAIX, PMSA
TAG-72, HER2
Grande stabilité
Facile à conjuguer Convient dans plusieurs applications: ELISA, PCR, IHC
Petite taille, propice pour le format puce
Révéler de nouveaux biomarqueurs intracellulaires en IHC
Limitations :Solutions :
Performance accrue souhaitéeSpécifique de l’application
Utiliser un mélange de nanocorps
Statut actuel : 
In vitro +++Applicable pour le diagnostic

 

Imagerie moléculaire

Construction :Avantages :
Cibles
PMSA, MMR, HER2, HGF, VCAM1, CAIX, EGFR
Marqueur
99mTc, 177Lu, 111In, 123I, 68Ga, 89Zr, 124I, 131I
Micro/nanobulles
IRDye800CW, IRDye700DX
Accumulation dans la tumeur rapide et homogène
Elimination sanguine rapide
Conjugaison facile
Imagerie précoce, procédure sûre
Combinaison imagerie et thérapie possible
La chirurgie guidée par l’image devient possible
Limitations :Solutions :
Accumulation dans les reins
Accumulation dans le foie et la rate
Accumulation dans le foie et les intestins
Supprimer l’His-tag
Co-injecter de la gelofusine et / ou de la lysine
Changer d’agent chélateur
Construction spécifique de nanocorps à administrer non marqué
Statut actuel : 
In vitro +++
In vivo :
Xénogreffes +++
Modèles de souris in vivo +++
Essais cliniques + (réussi)
Applicable pour l’imagerie
Potentiel à identifier de nouvelles cibles thérapeutique

D’après I. Van Audenhove, J. Gettemans / EBioMedicine 8 (2016) 40–48

 

Des anticorps de lama comme outils pour la R&D

LamaLes Nanocorps sont utilisés pour leur réaction spécifique sur les antigènes cibles, dans divers immunoassays, imagerie cellulaire et de l’immuno-targetting.

La partie Fc (heavy chain – non spécifique) est utilisée comme un tag (marqueur) que l’on fusionne à une protéine (recombinante) par fusion génétique. Ces LamaFc-Protéines servent d’immunogènes (pour de l’immunisation), et peuvent aussi servir comme antigène marqué dans divers immunoassays (en coating, ou en utilisant des anticorps secondaires -anti Ig de Lama-).

Toujours à l’écoute de la recherche, Interchim® offre désormais des protéines recombinantes liées à des nanocorps de Lama. La plupart de ces protéines sont des cibles thérapeutiques pour la recherche actuelle et future.
Des immunoréactifs issus des hcAbs de Lama sont aussi proposés.

 

En savoir plus :

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Anticorps de Lama et protéines taggées IgG Fc de lama


LamaLes anticorps de camélidés fournissent des outils biotechnologiques uniques en recherche (Anticorps entiers ‘hcAbs’, et fragment VHH ou ‘Nanobodies’), avec des applications prometteuses du diagnostique au thérapeutique.

Un peu d’histoire à propos des nanocorps

En 1993, de jeunes chercheurs ont découvert une nouvelle classe d’anticorps à domaine unique chez des chameaux. Ce nouveau type d’anticorps à chaîne lourde (hcIGs ou hcAbs) contient un seul domaine variable (VHH) et deux domaines constants (CH2, CH3). Cette forme rare d’anticorps se prête à la production du fragment spécifique VHH, le nanocorps qui est une alternative fascinante aux anticorps conventionnels.
Ces nanocorps peuvent être produits par immunisation classique d’animaux camélidés, mais aussi par génie génétique.
Ils présentent un intérêt tant en recherche (de l’analyse in vitro à l’imagerie moléculaire) qu’en diagnostic (comme sonde) et thérapeutique (comme médicament potentiel).

Principaux avantages des nanocorps :

  • En raison de leur petite taille, les nanocorps peuvent se lier à des épitopes difficiles d’accès aux anticorps traditionnels. Ils pénètrent aussi mieux les cellules et permettent de détecter ainsi des cibles intracellulaires ou masquées.
  • La stabilité des nanocorps est bien meilleure que celle des anticorps traditionnels.
  • Les nanocorps peuvent être facilement conjugués pour les fonctionnaliser
    (avec des agents fluorescents pour détecteur leur cible, avec des agents toxiques pour les adresser à des cellules et les tuer, ou avec des protéines, des résines, …)
  • Les nanocorps sont plus faciles à produire et modifier/optimiser
    par génie génétique, à partir d’une variété d’hôtes, de façon contrôlée.

Les Nanocorps sont utilisés pour leur réaction spécifique sur les antigènes cibles dans divers immunoassays, imagerie cellulaire et de l’immuno-targetting.
La partie Fc (heavy chain – non spécifique) est utilisée comme un tag (marqueur) que l’on fusionne à une protéine (recombinante) par fusion génétique. Ces LamaFc-Protéines servent d’immunogènes (pour de l’immunisation), et peuvent aussi servir comme antigène marqué dans divers immunoassays (en coating, ou en utilisant des anticorps secondaires -anti Ig de Lama-).

 

Protéines fusionnées avec les IgG Fc de lama :

Concues pour de l’immunisation (et d’autres applications: immuno-targetting, immunoassays)

  • Immunogénicité de la protéine taguée améliorée : Le tag ‘IgGFc’ a une faible immunogénicité, mais il peut favoriser la dimérisation des protéines
  • Pharmacocinétique : longue demi-vie et bonne stabilité
  • Haute pureté (Fig 1)
  • Haute activité (Fig 2)
  • Faible taux d’endotoxine (< 10 UE / mg).
Lama IgG2b Fc tag HumaineLama IgG2b Fc tag Humaine-2
Fig 1 : PD-1, Llama IgG2b Fc tag humaine (#PD1-H5259 ) sur SDS-PAGE dans des conditions dénaturantes (R). La pureté de la protéine est supérieure à 95%.BAFF His Tag humaine immobilisée, (#BAF-H5248 ) à 5 μg/mL (100 μL/puits) peut se lier à la BCMA Llama IgG2b Fc Tag Humaine, ( BCA-H5259 ) plage de 0,02-0,4 ng/mL.

 

> Liste des protéines conjuguées avec le tag lama IgG Fc (exclusif) :

MoleculeCat. No.Product DescriptionStructure
BCMABCA-H5259Human BCMA, Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructure BCMA
CD19CD9-H5250Human CD19 (20-291), Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructure CD19
CD30TN8-5250Human CD30, Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructure CD30
CD38CD38-H5252Human CD38, Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructureCD38
CD47CD7-H5251Human CD47, Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructure CD47
LAG-3LA3-H525cHuman LAG-3, Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructure LAG-3
PD-1PD1-H5259Human PD-1, Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructure PD1
PD-L1PDL-H5250Human PD-L1, Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructure PD-L1
Siglec-2SI2-H525aHuman Siglec-2, Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructure Siglec
Siglec-3CD3-H5259Human Siglec-3, Llama IgG2b Fc Tag, low endotoxinStructure Siglec-3

Accédez à plus de protéines recombinantes taggées LlamaFc.

 

Pour une utilisation future de biopanning en phage display, les protéines biotinylées correspondantes sont recommandées. Ces protéines peuvent être fixées à des surfaces recouvertes de Streptavidine (ex Microplaques ELISA) pour du criblage à haut débit.

> Liste des protéines conjuguées avec le tag lama IgG Fc (exclusif) :

MoleculeCat. No.Product DescriptionStructure
BCMABC7-H82F0Biotinylated Human BCMA / TNFRSF17 Protein, Fc Tag, Avi Tag (Avitag™)Structure BCMA Fc Avitag
CD30CD0-H82E6Biotinylated Human CD30 / TNFRSF8 Protein, Avi Tag (Avitag™)Structure CD30 Avi His Fc
CD38CD8-H82E7Biotinylated Human CD38 Protein, Avi Tag (Avitag™)Structure D38 Avi His
CD47CD7-H82E9Biotinylated Human CD47 Protein, Avi Tag (Avitag™)Structure CD47 His Avi
LAG-3CD7-H5251Biotinylated Human LAG-3, Mouse IgG2a Fc Tag, (Avitag™)Structure LAG-3 mFc Avi
PD-1LA3-H525cBiotinylated Human PD-1, (recommended for biopanning)Structure PD-1 Avi His
PD-L1PD1-H5259Biotinylated Human PDL-1/B7-H1, (recommended for biopanning), Avi Tag (Avitag™)Structure PD-L1 Avi His
Siglec-2PDL-H5250Biotinylated Human Siglec-2, Fc Tag, (Avitag™)Structure Siglec-2 Fc Avi
Siglec-3SI2-H525aBiotinylated Human Siglec-3 / CD33 Protein, (Avitag™)Structure Siglec-3 Avi His

Accédez à plus de protéines recombinantes Avi-taggées.

 

Immunoréactifs de lama :

> Anticorps secondaires de Lama

Les anticorps de lama immunisés envers des IgG de différentes espèces et purifiés par affinité puis marqués par différents marqueurs fluorescents, la biotine ou l’HRP, sont utilisés dans les immunoassays.

Llama AbAnti Mouse IgG(H+L)
Lyo(1mg) or 2mg/ml (50&500μl)
Anti Rabbit IgG(H+L)
Lyo(1mg) or 2mg/ml (50&500μl)
CF488A204542449
CF5682045520450
CF5942045620451
CF640R2045720452
CF6472045820453

 

> Anticorps de Lama immobilisés

Llama Igg Coupled 4% Agarose Beads OOIB00006, 2 ml

 

> Anticorps de Lama pour Controles

 Unconj.BIOTINFITCHRP
Control Normal Llama IgGXR-8001XR-8013XR-8005XR-8009
Control Normal Llama IgG1XR-8002XR-8014XR-8006XR-8010
Control Normal Llama IgG2XR-8004XR-8016XR-8008XR-8012
Control Normal Llama IgG3XR-8003XR-8015XR-8007XR-8011

 

> Sérum et Ig de Lama

Normal Llama serumOOIB00013, 2mlOOIB00012, 10ml
Llamma IgOOIB00043, 10mg– – –
Llamma IgGOOIB00044, 10mg– – –

 

> Anticorps secondaires anti Ig de Lama

Anti-Llama IgG (H+L)Goat antiRabbit anti
Unconjugated41R-1045, 1 mg41R-1046, 1mg
HRP43R-1284, 1 mg43R-1290, 1mg
AP43R-1281, 500 μg43R-1287, 500 μg
Biotin43R-1282, 1 mg43R-1288, 1 mg
FITC43R-1283, 1 mg43R-1283, 1 mg
Rhodamine43R-1285, 1 mg– – –
RPE13415, 1 unité– – –
APC13393, 1 unité– – –

Accédez à plus d’immunoréactifs et anticorps de Lama.

 

En savoir plus :

  • Voir l’article Nano-Anticorps
  • N’hésitez pas à nous demander des produits & services similaires: Camel/Alpaga antibodies, custom production, antibody purification …

A savoir que les VHH peuvent être produits à partir d’une large gamme d’immunogènes (nucléotides naturel ou modifié, peptide avec ou sans modification post-traductionnelle, protéine, microorganisme, haptènes…).

Cela passe par l’immunisation de lamas, puis la construction d’une bibliothèque de phage display (phages comportants l’ADNc codant pour le VHH qui sont utilisée pour présenter les VHH dans des tests), la sélection des phage/VHH d’interêt, et enfin la production (qui peut être à grande échelle).

Les nanocorps ont une plus grande stabilité que les anticorps classiques,
. conformationnelle et thermique (jusqu’à 60°C / 140°F)
. et chimique (il supportent une plus large gamme de pH).

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L’effet de la température sur la chimie de PhotoRedOx


Le contrôle de la température des réactions de photoredox n’est pas facilement réalisable. La plupart des protocoles sont décrits en utilisant un ventilateur pour maintenir la réaction proche de la température ambiante et en n’utilisant pas le ventilateur pour laisser la réaction monter en température. De plus, il y a très peu de systèmes décrits permettant à la réaction de se dérouler en-dessous de la température ambiante. Dans ce contexte, il est très difficile d’étudier l’effet de la température sur la photocatalyse de manière pratique.

PhotoRedOx TCHepatoChem a développé un appareil le PhotoRedOx TC (Température Contrôlée) qui permet ce type d’expériences faciles à mettre en œuvre en utilisant un simple circulateur de fluide refroidissant ou chauffant.
Le PhotoRedOx TC (Température Contrôlée) est compatible avec de nombreuses sources lumineuses comme par exemple les différentes LEDs EvoluChem 18W. Il dispose d’une chambre de photochimie permettant une distribution uniforme de la lumière. On peut utiliser plusieurs formats de flacons (de 0.3ml à 20ml) grâce à différents portoirs. Le réacteur de chimie en continue peut également être utilisé avec cet appareil. Sont nécessaires à l’utilisation du PhotoRedOx TC une plaque agitatrice magnétique pour assurer l’agitation et un circulateur de fluide externe afin de chauffer ou refroidir les flacons réactionnels. (les sources lumineuses, les portoirs, le réacteur de chimie en continue, la plaque agitatrice et le circulateur de fluide sont fournis indépendamment)

Dans les exemples suivants, HepatoChem montre comment l’alkylation CH utilisant un réactif BF3K peut tirer profit d’une température plus basse ; et comment l’augmentation de la température peut accroître le rendement d’une réaction de cross-coupling C-O.

 

PhotoRedOx TC (Température Contrôlée)

  • Compatible avec beaucoup de sources lumineuses (EvoluChem 18 W)
  • Chambre de photochimie permettant la distribution uniforme de la lumière
  • Compatible avec plusieurs formats de flacons (de 0.3mL à 20mL)
  • Réacteur de chimie en continue disponible
  • Agitation sur une plaque agitatrice magnétique
  • Circulateur de fluide externe nécessaire pour chauffer ou refroidir les flacons réactionnels

 

Réaction Cyclopropyl BF3K et Hydroquinine

Reaction_Cyclopropyl BF3K & Hydroquinine

Rendement de la réaction à 19°C, 28°C et 50°C

Reaction_Cyclopropyl BF3K & Hydroquinine

Détails expérimentaux : La réaction est réalisée dans la PhotoRedOx Temperaure Controlled EvoluChem avec un bain circulant de Polyethylene glycol/Eau et une LED EvoluChem 18W 6200K white pendant 2 h. Cette réaction contient 50 µmol de substrat,
1.5 équiv. de BF3K, 2 équiv. de K2S2O8, 5 équiv. TFA et 2 mol% Ir(dF-CF3-ppy)2(dtbpy) dans 0.5ml de DMSO.

 

Couplage C-O avec le cyclohexanol

Couplage_C-O_avec_cyclohexanol

Couplage_C-O_avec_cyclohexanol-2

Détails expérimentaux : La réaction est réalisée dans la PhotoRedOx Temperature Controlled EvoluChem avec une LED EvoluChem 450nm.
Réaction : 2 mol% Ir(dF-CF3-ppy)2(dtbpy), 5 mol% NiCl2-dme/dtbpy et 3 équiv. base avec 10 mol% quinuclidine. Le rendement a été déterminé par LC-UV.

En savoir plus :

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Guide : Préparation d’échantillons & filtration, comment bien choisir vos membranes pour optimiser cette étape


1. De l’importance de la filtration pour réussir vos préparations d’échantillons

Etape indispensable de la préparation d’échantillons, la filtration permet, par passage à travers une membrane spécifique, de débarrasser un fluide des particules solides qui s’y trouvent en suspension.

Elle recouvre des domaines d’application divers et variés :

  • En biologie ou biochromatographie, cette technique permet d’éliminer des virus, des bactéries voire même d’isoler d’une matrice des protéines à fortes masses moléculaires. Pour cela, des filtres stériles sont couramment utilisés.
  • En chromatographie ou en chimie, que ce soit dans le  pharmaceutique, la cosmétique, l’agrochimie ou l’environnement…, on parle de filtration de matières en suspension insolubles. L’utilisation de la filtration limite la détérioration précoce des consommables (GC-HPLC).

L’utilisation d’automates adaptés permet le traitement rapide d’un très grand nombre d’échantillons. Ainsi, il est possible de réaliser de 96 jusqu’à 384 filtrations en simultané sur une même plaque.

D’autres fabricants comme Sotax ou Zymark proposent des automates de filtration utilisant des filtres seringues à géométrie spécifique, pour la filtration d’échantillons issus de la dissolution de formulations pharmaceutiques.

Moins onéreuse, la filtration manuelle sur filtres seringues, papiers ou membranes filtrantes reste la plus utilisée dans les laboratoires pour traiter des échantillons liquides ou des solvants. Ces produits répondent aux besoins d’un grand nombre d’utilisateurs.

Les filtres sans seringue ou vial filtrant sont les dernières innovations en terme de filtration. Ils réduisent considérablement le temps de préparation des échantillons et peuvent directement s’insérer sur les auto-échantillonneurs couplés aux systèmes d’analyses.

Organigramme Filtration

 

2. Les critères à prendre en compte pour le choix de vos membranes

La porosité de la membrane définit le seuil de filtration, c’est-à-dire le diamètre maximum des particules qui pourront la traverser. Elle varie généralement entre 5 et 0,20 μm. Le choix du diamètre du filtre et de la porosité de la membrane doit toujours tenir compte du volume de l’échantillon et du type d’analyse qui sera pratiquée ultérieurement. Une porosité de filtration de 0,45 μm est nécessaire pour tous les solvants et échantillons avant une  analyse HPLC. Cette précaution limite les problèmes de montée en pression des systèmes. Pour l’utilisation de colonnes dont le diamètre de particules est inférieur à
3 μm, une filtration à 0,2 μm devient obligatoire.
En chromatographie gazeuse, l’encrassement de l’insert d’injection est limité si l’échantillon est correctement filtré.
Pour la filtration de matrices chargées, les filtres seringues munis d’un pré-filtre diminuent les problèmes de colmatage de la membrane et évitent ainsi leurs multiples remplacements durant la filtration.

 

3. Le guide de sélection

Cellulose régénérée (RC)

Membrane hydrophile ayant les mêmes propriétés que l’acétate de cellulose mais stable avec la plupart des solvants HPLC. Elle peut être utilisée pour la filtration ou le dégazage des solvants HPLC. Elle est compatible avec les solutions aqueuses dans une fourchette de pH comprise entre 2 et 12. C’est un matériau de choix pour la filtration des protéines lorsqu’un taux de récupération maximum est nécessaire, il présente un très faible taux d’adsorptions non spécifiques.


Esters de cellulose (MEC)

Membrane idéale pour filtrer les échantillons en solutions aqueuses. Faible résistance aux solvants. Avec préfiltre en fibre de verre, elle est utilisée pour la filtration des milieux de cultures et des échantillons biologiques ainsi que pour la clarification et la stérilisation des solutions aqueuses. Très faible adsorption des protéines (adsorption inférieure aux membranes PVDF et Polysulfone). Le préfiltre en fibre de verre multiplie par 3 le volume filtrable.


Nylon et Nylon Low Extractibles (LE)

Membrane fréquemment employée pour la filtration des échantillons HPLC avant injection.
Bonne résistance aux solvants. Caractéristiques hydrophiles, donne de bons résultats avec les solutions aqueuses. Déconseillée pour la filtration des protéines lorsqu’un taux de récupération maximum est nécessaire.


Polypropylène (PP)

Très résistante, peut être utilisée avec tous les solvants et acides. La résistance d’un filtre à coque de polypropylène est limitée par la résistance de la membrane filtrante.

 

PVDF

Membrane hydrophobe ayant une bonne résistance aux solvants. Elle est excellente pour la filtration des solvants HPLC, de même que pour la plupart des solutions biologiques. La membrane PVDF est considérée comme étant celle qui présente le plus faible taux d’adsorption de protéines.


PVDF-HLC (hydrophile)

Membrane hydrophile, sans extractibles, ayant une très bonne compatibilité avec les solutions 100% aqueuses. Elle présente un très faible taux d’adsorption des protéines et est par conséquent recommandée pour la filtration des milieux biologiques.


PTFE

Membrane hydrophobe, chimiquement résistante aux solvants, acides et bases. La membrane PTFE ne relargue pas d’impuretés dans le filtrat. Elle est idéale pour la filtration des solvants HPLC non aqueux.


PTFE-HLC (hydrophile)

Membrane hydrophile, sans extractibles, ayant une très bonne compatibilité avec les solutions aqueuses et organiques. Haute résistance au pH et à la température, faible taux d’adsorption des protéines.

 

Fibres de verre (GMF/GF)

Couramment utilisées comme préfiltre dans la plupart des filtrations. Certaines de ces membranes sont employées pour le lavage et la purification de DNA.


Polyéthersulfone (PES)

Membrane hydrophile avec un très faible taux d’adsorption pour les protéines et acides nucléiques. Très forte résistance mécanique de la membrane permettant la filtration rapide de grand volume d’échantillon. Dédiée principalement à la filtration de cultures cellulaires. Compatible avec les alcools et bases fortes.


Nitrocellulose (NO2)

Membrane hydrophile recommandée pour la clarification et filtration d’échantillons aqueux au même titre que les membranes en MEC.

 

Acétate de cellulose (CA)

Membrane hydrophile fréquemment utilisée pour la filtration de solutions aqueuses.
Elle présente un très faible taux d’adsorption protéique. Sa résistance chimique aux solvants est moins importante que celle des membranes RC.

4. Pour rappel :

PTFE : Polytétrafluoroéthylène
PTFE-HLC : Polytétrafluoroéthylène hydrophile
PVDF : Polyvinylidine difluoride
PVDF-HLC : Polyvinylidine difluoride hydrophile
RC : Cellulose régénérée
MEC : Mélange d’esters de cellulose
PES : Polyéthersulfone
NO2 : Nitrocellulose
GF : Fibre de verre
GMF : Micro fibre de verre
Nylon : Polyamide 6
Nylon LE : Nylon à faible taux d’extractibles
PP : Polypropylène
PP-2 : Polypropylène hydrophile
PE : Polyéthylène
UH-PE : Polyéthylène haute densité
CA : Acétate de cellulose

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