Les supports de purification des molécules biologiques – Protéines, protéines recombinantes & les techniques de purification possibles avec l’agarose


Qu’est-ce que l’agarose ?

Il s’agit d’une chaine carbohydratée polymèrique linéaire, dont l’unité de base est le disaccharide agarobiose, extraite des algues rouges tels que Gelidium et Gracilaria.

MotifDeBaseAgarose

Algues

L’agarose fond à environ 100°C et solidifie à environ 45°C. Après refroidissement, le polymère s’agrège en une structure de fibre en double hélice.

StructureGel

FormationOfPoresInAgaroseGel

Gel d'agarose agrandi 50 000 fois

Gel d’agarose agrandi 50 000 fois

Caractéristiques de l’agarose :

  • L’ami des protéines : elles ne sont pas abimées au contact de l’agarose
  • Très grande capacité
  • Très grande sélectivité
  • Stable chimiquement (pH 1-14)
  • Facile à utiliser et présente une grande résistance mécanique
  • Très bien connue (70 – 75% des purifications des biomolécules sont réalisées avec l’agarose)

L’agarose est extrêmement hydrophile ce qui limite au maximum les liaisons non spécifiques. Son faible volume solide (4-8 %) lui confère une très importante capacité de charge. Sa structure hydrocarbonée la rend très facilement activablable, donc l’agarose est utilisable dans toutes les techniques de purification (Echange d’ions, Affinité Protéine A & IMAC, Exclusion, Hydrophobicité). Enfin, comme elle est très stable en conditions alcaline, elle peut subir les sanitisations et CIP (Cleaning In Place), qui détruisent toutes les impuretés ou protéines restantes sur le support, ce qui en fait le matériel de choix pour les purifications des protéines.

L’agarose est par nature molle, et donc pour résister à la pression engendrée lors des purifications, elle nécessite lors de sa synthèse des émulsifications et des technologies de réticulations très sophistiquée. Ceci explique le coût élevé de l’agarose comparée aux résines polymériques synthétiques. Enfin, l’agarose est un polymére naturelle ce qui implique des variations de la qualité du matériel de base (l’agarobiose).


Les techniques de purifications disponibles avec l’agarose :

L’agarose étant très facilement activable, elle peut être modifiée pour donner des supports de Chromatographie par échange d’ions (IEX – Ion Exchange Chromatography, d’affinité (IMAC- Immobilized Metal Affinity Chromatography et Protéine A), d’hydrophobicité (HIC – Hydrophobic Interaction Chromatography) et d’exclusion (SEC – Size Exclusion Chromatography).

 

IEX

SchemaFnctIEX1

Gradient de force ionique et déplacement de protéine faiblement associée à la résine

Elution progressive des protéines avec l’augmentation du gradient de force ionique

Elution progressive des protéines avec l’augmentation du gradient de force ionique

Mode de fonctionnement de l’IEX

  • Interactions électrostatiques entre une molécule chargée et un support chargé de façon opposée.
  • La charge de surface de la protéine dépend du pH

La valeur de pI de la protéine (pH auquel la charge nette de la protéine est nulle) est l’indice du pH à utiliser pour une excellente adsorption de la molécule sur le support.

 

Affinité

SchemaFnctAffinite

Mode de fonctionnement de l’Affinité

Séparation basée sur des interactions spécifiques Molécule d’intérêt/Support de purification

Il existe de nombreuses techniques de séparations pour des protéines naturelles ou recombinantes :

  • Support protéine A pour les anticorps
  • Immobilized Metal Ion Chromatography (IMAC) pour les protéines taggées Histidine
  • Support Glutathion pour les protéines taggées GST


HIC

SchemaFnctHIC

Mode de fonctionnement de l’HIC

L’échantillon protéique est dissout dans un tampon de sel de haute concentration. Les molécules d’eau près de la surface du ligand et de la surface hydrophobe de la protéine sont plus ordonnées qu’en solution (effet “protection”). Le déplacement des molécules d’eau entourant le ligand et la région H de la protéine donne lieu a une augmentation d’entropie rendant ainsi cette interaction thermodynamiquement favorisée. Interactions de type van der Waals augmentent entre le ligand et la région H avec l’augmentation de la structure ordonnée de molécule d’eau en présence de sel (“salting out”).

 

SEC

SEC

Mode de fonctionnement de la SEC

Basée sur la taille des molécules, l’ordre d’élution est inversement proportionnel au rayon hydrodynamique (taille, dimension) de la molécule. Il n’y a aucune interaction entre le support de chromatographie et les molécules à séparer.


Laissez un commentaire

Votre adresse email ne sera pas publiée. Les champs marques* sont requis.