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Procédure de rinçage colonne C18

PostPosted: Thu 16 Jun 2016 16:44
by MlleGC
Bonjour,

Quelle procédure de rinçage pouvez-vous me donner pour des colonnes phase inverse greffées C18 ?

Merci bien,

MlleGC

Re: Procédure de rinçage colonne C18

PostPosted: Thu 16 Jun 2016 16:58
by Ticus
Bonjour,

La mise en service de ta colonne dans tes conditions opératoires peut être effectuée comme suit :
Equilibrage à faible débit (0.5mL/min) en 100% ACN : 5 volumes de colonne soit 20mL.
Augmenter progressivement la proportion de MeOH (jusqu'à tes conditions d'injection soit 35%) ainsi que le débit à 1mL/min.
Laisser équilibrer la pression sur 30min.


Ticus

Re: Procédure de rinçage colonne C18

PostPosted: Thu 16 Jun 2016 17:09
by MlleGC
Merci bien Ticus !

Re: Procédure de rinçage colonne C18

PostPosted: Mon 28 Nov 2016 19:34
by Olivier-LCSupport
Bonjour à tous,
Je souhaiterais faire une intervention pour préciser le contexte :
1) Il est important de définir s’il s’agit de silice totalement poreuse, de Core Shell ou silice superficiellement poreuse, ou de polymère. Tous ces supports peuvent être greffés C18.
Les volumes poreux de ces matériaux sont différents et n’aboutissent pas aux mêmes protocoles de rinçage, et plus précisément aux mêmes solvants et volumes de solvants.
2) Quand on parle de procédure de rinçage pour colonnes phase inverse, il s'agit d'une procédure valable pour toutes les phases stationnaires utilisables en phase inverse (C18, C8, C4, Phényl, Phényl/Héxyl, PFP, ...) qu’elles soient pour une utilisation HPLC analytique, ou préparative.

Prenons l’exemple des silices poreuses greffées C18.
Quelle serait une procédure de rinçage efficace ? Quels solvants utiliser ? Pendant combien de temps ? A quel débit ?

Rappelons que l’objectif d’une procédure de rinçage est d’éliminer des polluants chimiques ou physiques qui seraient adsorbés sur la colonne et qui en changeraient la performance chromatographique. Le but d’une telle procédure est de passer une série de solvants sur la colonne de façon à essayer d’éliminer ces polluants.
Tous les solvants doivent être miscibles entre eux. (Attention phases mobiles contenant des tampons salins)

Quels solvants à utiliser en phase inverse pour une procédure de rinçage ?
Couramment, les phases mobiles utilisées en RPLC sont constituées d’eau H2O (tamponnée ou pas), d’acétonitrile (ACN), de méthanol (MEOH)

On distingue 2 cas :
1) Après l’utilisation d’une colonne, on parle d’une procédure de rinçage dit de « fin de cycle », l’objectif est de rincer la colonne pour la stocker provisoirement (quelques jours) avant une utilisation ultérieure.

Exemple : Analyse sur une colonne 250x4.6mm 5µm C18, méthode ACN / H2O + tampon Phosphate à pH 3 (50/50)
Quelle procédure de rinçage puis-je utiliser après mon analyse ?
Il suffit de rincer la colonne avec une phase mobile ACN / H2O sans tampon (50/50) pendant 7VolCol puis la boucher pour un stockage court
NB : toujours stocker la colonne avec au moins 50% de phase organique (ACN ou MeOH) et sans tampon.


2) Lors de l’utilisation, on détecte un problème de montée en pression, ou on observe une modification du profile chromatographique de référence (dédoublement, trainées de pics …)
Dans ce cas, vous pouvez envisager une procédure de rinçage plus complète comme suit :

Reprenons cet exemple : Analyse sur une colonne 250x4.6mm 5µm C18, méthode ACN / H2O + tampon Phosphate à pH 3 (50/50)
Rinçage :
ACN / H2O sans tampon (50/50) : 10 VolCol
ACN 100% : 7 VolCol
MeOH 100% : 7 VolCol
ACN / H2O sans tampon : 7 VolCol

La colonne rincée est prête pour un nouveau conditionnement avec la phase mobile d’analyse : ACN / H2O + tampon Phosphate à pH 3 (50/50) : 7 VolCol

NB : Les débits des solvants doivent être adaptés pour éviter des rinçages à trop forte pression surtout si vous changez le sens d’utilisation de la colonne.
Attention, changer le sens d’utilisation de la colonne ne doit être fait que si le constructeur vous le propose.
Non pleinement encadré, cela peut détériorer la bonne qualité de remplissage de celle-ci.

Détermination du VolCol ou volume poreux d’une colonne
VolCol : (Pi x D²)/4 x L x 0,67
D : diamètre de la colonne en cm
L : longueur en cm
0,67 : coefficient pour la porosité pour des silices poreuses 5µm 120A

Exemple d’une colonne 250x4.6mm
VolCol = (3,14*0,46*0,46)/4} * 25 * 0,67 = 2,8ml
Donc pour une étape de rinçage de 10VolCol, on doit passer 28ml soit 28 minutes à 1ml/min

Ces calculs s’appliquent pour tous les dimensions de colonnes HPLC

Bien à vous