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Préparation de l'échantillon :
- Si un échantillon doit refléter exactement l'état des cellules au moment
de la lyse, il est nécessaire de choisir une procédure qui préviendra l'action d'enzymes telles les
protéases, phosphatases et kinases. Les protéines étrangères qui peuvent être présentes dans les milieux de
culture, particulièrement l'albumine sérique et les immunoglobulines, affectent les concentrations en protéine
et peuvent altérer leur migration électrophorétique. Par conséquent, pour la lyse de cultures de cellules
adhérentes, il est indiqué d'éliminer le milieu de culture et de rincer rapidement les cellules avec du tampon PBS
avant la lyse. Une fois les cellules rincées, jeter l'excès de PBS et l'éliminer par aspiration. A une boite de
culture de 10 cm de diamètre, ajouter 1 ml de tampon d'échantillon d'électrophorèse 2X bouillant
(1X = 125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 5% glycérol, 0,003% bleu de bromophénol, 1% b-mercaptoéthanol).
Alternativement, les cellules rincées au PBS peuvent être lysées avec 1 ml de tampon de lyse bouillant
(SDS 1%, Tris 10 mM, pH 7,4) pour une boite de 10 cm de diamètre. Racler les cellules de la boite, transférer dans un
microtube et faire bouillir 5 minutes supplémentaires. La viscosité de l'échantillon peut être réduite
par une brève sonication ou plusieurs passages à travers une aiguille de gauge 26. Centrifuger les échantillons
5 minutes pour éliminer le matériel insoluble. A ce point, il est possible de déterminer la concentration en
protéine sur une petite aliquote par la méthode BCAssay (Uptima UP40840A). Diluer l'échantillon pour ramener
la concentration en SDS à 0,1 % pour éviter l'interférence du détergent avec la lecture colorimétrique.
Cette méthode permet une meilleure comparaison des échantillons. Les échantillons sont alors prêts pour
l'électrophorèse.
- Les échantillons de tissus peuvent être préparés par homogénéisation rapide dans
5 fois leur volume de tampon de lyse bouillant (1% SDS, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4) et passage 10-15 secondes au micro-ondes.
Centrifuger les homogénats 5 min (12,000 g, 15°C) pour éliminer le matériel insoluble.
Electrophorèse sur gel de polyacrylamide et blotting :
- Si les échantillons ne sont pas déjà dilués, ajouter le tampon
d'échantillon d'électrophorèse et faire bouillir 3 à 5 minutes. A chaque puits d'un gel de
polyacrylamide-SDS de 0,5 à 0,75 mm d'épaisseur, appliquer 5-25 µl de lysat cellulaire ou homogénat
de tissu (1-10 µg de protéine) et faire migrer
- Transférer (tampon de transfert : Tris 25 mM, glycine 190 mM, MeOH 20%) sur une membrane
de difluorure de polyvinylidène (PVDF) à 1 ampère pendant une heure ou équivalent dans un appareil
de transfert humide ou 45 minutes à 0,7 ampère dans un appareil de transfert semi-sec. Les protéines
transférées peuvent être visualisées en colorant la membrane avec de l'encre indienne (Pelikan)
diluée au 1/1000 dans le tampon de lavage (10 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20). Rincer l'excès de
colorant avant de bloquer.
Blocage de la membrane :
- Retirer le blot de l'appareil et le placer immédiatement dans le tampon de blocage
(1% BSA, 10 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1% Tween 20)
- Incuber 20 minutes à 37°C.
* note : la présence d'azide de sodium doit être évitée dans cette étape et les suivantes
Incubation avec les anticorps conjugués à la péroxydase :
- Retirer le tampon de blocage et ajouter le conjugué péroxydase dilué
dans le tampon de blocage (anti phosphotyrosine-péroxydase E120H au 1/2500, PY20-péroxydase (Réf. P11625)
et MK12-péroxydase (réf M12325) au 1/1000)
- Incuber sous agitation 20 minutes à 37°C, 1 heure à température ambiante
ou une nuit à +4°C.
Incubation avec le substrat :
- Eliminer la solution d'anticorps et ajouter le tampon de lavage (10 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl,
0,1% Tween 20)
- Laver 15 minutes sous agitation en changeant le tampon de lavage toutes les 2-3
minutes
- Retirer le tampon de lavage et ôter l'excès d'humidité en épongeant
rapidement le blot avec un papier absorbant
- Ne pas laisser sécher les blots !
- Placer le(s) blot(s) dans un sac plastique contenant le substrat chimioluminescent
(SuperSignal CL-HRP substrate system Pierce Réf. 34080)
- Procéder comme recommandé par les instructions données avec le
substrat
- Déposer un film Kodak X-OMAT AR sur le(s) blot(s) jusqu'à l'exposition optimale.
Une exposition initiale de 10 secondes est recommandée et devra être optimisée
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