PROTOCOLE Transduction Laboratories #10

Dosage de protéine kinases obtenues par immunoprécipitation

Lyse des cellules:

Utiliser une culture confluante réalisée sur une boite de 10 cm de diamètre. Les cellules, non stimulées ou traités avec un mitogène (PMA, EGF, PDGF, sérum, etc.) sont rincées rapidement avec du PBS pH 7,4. La lyse est initiée par addition d'1 ml de tampon de lyse froid (10 mM Tris pH 7,4, 1,0% Triton X-100, 0,5% Nonidet P-40, 150 mM NaCl, 20 mM sodium fluoride, 0,2 mM sodium orthovanadate, 1,0 mM EDTA, 1,0 mM EGTA, et 0,2 mM PMSF). La lyse est poursuivie 30 minutes à +4°C sous agitation constante. Les cellules sont grattées et le lysat est passé plusieurs fois au travers d'une aiguille de gauge 26 pour disperser les agrégats. Le matériel insoluble est éliminé par centrifugation 30 minutes à +4°C. Le surnageant obtenu est le lysat cellulaire total.

Immunoprécipitation de la protéine kinase:

Le lysat cellulaire (0,2 - 1 mg de protéine) est incubé avec 2-5 µg d'anticorps solubles ou 25 µl de suspension d'anticorps couplé sur agarose. L'immunoprécipitation est effectuée 1 heure à +4°C sous agitation (agitateur rotatif). Si un anticorps monoclonal soluble a été utilisé, incuber les complexes 30 minutes à +4°C avec un volume égal d'anticorps de lapin anti IgG de souris. Les complexes immuns sont ensuite incubés à +4°C avec 50 µl d'une suspension à 10% de protéine A (préalablement lavée dans le tampon d'immunoprécipitation, voir protocole 7). L'addition d'anticorps de lapin anti IgG de souris ou de protéine A n'ont pas lieu d'être si l'anticorps était couplé sur agarose. Les complexes sont lavés au moins trois fois par resuspension dans le tampon d'immunoprécipitation et collecte par centrifugation 3 minutes dans une centrifugeuse de paillasse à +4°C.

Dosage de la Kinase:

Les immuncomplexes sont lavés 3 fois à +4°C avec le tampon kinase (10 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 et 0,5 mM DTT). Le surnageant est ensuite retiré par aspiration. Le culot est incubé 15 minutes avec 40 µl de tampon kinase contenant 25 mM ATP, 2,5 µCi [g-32P]ATP et le substrat protéique approprié* à 0,1 mg/ml. La réaction est menée à 37°C pendant 15 minutes et terminée par addition de 15 µl de tampon d'échantillon d'électrophorèse 5X bouillant. La solution est mise à bouillir 5 minutes supplémentaires. Les échantillons sont centrifugés et le surnageant analysé par électrophorèse. Le gel est ensuite fixé et coloré au bleu de Coomassie (0,25% dans une solution à 45% de méthanol et 10% d'acide acétique), décoloré (40% méthanol, 10% acide acétique), séché et exposé sur un film sensible aux rayons X. L'activité kinase sera indiquée par une bande de protéine phosphorylée.

Substrats protéiques communément employés pour le dosage spécifique des kinases: