PROTOCOLE Transduction Laboratories #11

Dosage de protéine kinases après dénaturation et renaturation de l'enzyme

Préparation du lysat cellulaire:

Partir d'une culture confluante sur une boite de 60 mm, rincer les cellules avec du PBS et ajouter 0,5 ml de tampon de lyse bouillant (1% SDS, 10 mM Tris-HCl pH 7,4). Transférer dans un microtube de 1,5 ml et faire bouillir 5 minutes supplémentaires. Passer aux ultrasons brièvement ou passer plusieurs fois à travers une aiguille de gauge 26 et centrifuger 5 minutes. Le lysat obtenu est un «lysat cellulaire total».

Immunoprécipitation et électrophorèse:

Immunoprécipiter la MAP kinase (ERK) comme indiqué dans le protocole 7 (conditions dénaturantes).

Préparer un gel de polyacrylamide contenant 1 mg/ml de myelin basic protein ou récepteur à l'EGF (amino acides 663-683) dans le gel de résolution. Le gel de préconcentration (stacking) est préparé sans le substrat. Faire migrer les ERKs immunoprécipitées ainsi que les standards de poids moléculaire appropriés.

Élimination du SDS:

Après électrophorèse, laver le gel avec une solution à 20% de 2-propanol en Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 pendant une heure sous agitation constante. Changer le tampon de lavage au moins deux fois. Cette étape ôte le SDS du gel. Incuber le gel 1 heure dans 250 ml de tampon A (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5 mM DTT) sous agitation continue.

Dénaturation:

Incuber le gel 1 heure à température ambiante dans une solution de Guanidine HCl 6M dans le tampon A, sous agitation continue.

Renaturation:

Renaturer les protéine kinases en incubant le gel dans le tampon A contenant 0,04% de Tween-40. La renaturation est poursuivie 16 heures à +4°C sous agitation constante, le tampon de renaturation doit être changé au moins 3 fois.

Dosage de la Kinase:

Le gel est pré-incubé dans le tampon de dosage (40 mM Hepes-HCl pH 8,0, 2,0 mM DTT, 0,1 mM EGTA, 5 mM magnésium acétate) à température ambiante sous agitation constante. Le dosage de la kinase est effectué en incubant le gel 1 heure à température ambiante dans le tampon de dosage + 5-50 µCi [g32P]-ATP. S'assurer que le gel est entièrement recouvert par le mélange réactionnel dont le volume est usuellement de 15-20 ml pour un gel de 15x18 cm. Ce volume peut être réduit si la réaction est effectuée dans un sac plastique.

Détection:

Laver le gel au moins 3 fois avec une solution à 5% w/v d'acide trichloracétique et 1% de pyrophosphate de sodium. Les lavages doivent être effectués de façon répétée pendant environ 1h30 pour réduire le bruit de fond. Sécher le gel sous vide sur du papier Whatman 3MM et impressionner un film sensible aux rayons X et écran intensificateur à -80°C. L'activité ERK sera indiquée par la phosphorylation de la myéline adjacente à l'ERK (P.M. 42-44 kDa).

Références:

Campos-González, R. and Glenney, Jr., J. R. (1992) J. Biol. Chem. 267: 14535

Kameshita, I. and Fujisawa, H. (1989) Anal. Biochem. 176: 22