PROTOCOLE Transduction Laboratories #2

Western blotting avec des conjugués phosphatase alcaline

Préparation de l'échantillon:

Si un échantillon doit refléter exactement l'état des cellules au moment de la lyse, il est nécessaire de choisir une procédure qui préviendra l'action d'enzymes telles les protéases, phosphatases et kinases. Les protéines étrangères qui peuvent être présentes dans les milieux de culture, particulièrement l'albumine sérique et les immunoglobulines, affectent les concentrations en protéine et peuvent altérer leur migration électrophorétique. Par conséquent, pour la lyse de cultures de cellules adhérentes, il est indiqué d'éliminer le milieu de culture et de rincer rapidement les cellules avec du tampon PBS avant la lyse. Une fois les cellules rincées, jeter l'excès de PBS et l'éliminer par aspiration. A une boite de culture de 10 cm de diamètre, ajouter 1 ml de tampon d'échantillon d'électrophorèse 2X bouillant (1X = 125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 5% glycérol, 0,003% bleu de bromophénol, 1% b-mercaptoéthanol). Alternativement, les cellules rincées au PBS peuvent être lysées avec 1 ml de tampon de lyse bouillant (SDS 1%, Tris 10 mM, pH 7,4) pour une boite de 10 cm de diamètre. Racler les cellules de la boite, transférer dans un microtube et faire bouillir 5 minutes supplémentaires. La viscosité de l'échantillon peut être réduite par une brève sonication ou plusieurs passages à travers une aiguille de gauge 26. Centrifuger les échantillons 5 minutes pour éliminer le matériel insoluble. A ce point, il est possible de déterminer la concentration en protéine sur une petite aliquote par la méthode BCA (Pierce). Diluer l'échantillon pour ramener la concentration en SDS à 0,1 % pour éviter l'interférence du détergent avec la lecture colorimétrique. Cette méthode permet une meilleure comparaison des échantillons. Les échantillons sont alors prêts pour l'électrophorèse.

Les échantillons de tissus peuvent être préparés par homogénéisation rapide dans 5 fois leur volume de tampon de lyse bouillant (1% SDS, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4) et passage 10-15 secondes au micro-ondes. Centrifuger les homogénats 5 min (12,000 g, 15°C) pour éliminer le matériel insoluble.

Electrophorèse sur gel de polyacrylamide et blotting :

Si les échantillons ne sont pas déjà dilués, ajouter le tampon d'échantillon d'électrophorèse et faire bouillir 3 à 5 minutes. A chaque puits d'un gel de polyacrylamide-SDS de 0,5 à 0,75 mm d'épaisseur, appliquer 5-25 µl de lysat cellulaire ou homogénat de tissu (1-10 µg de protéine) et faire migrer.

Transférer (tampon de transfert : Tris 25 mM, glycine 190 mM, MeOH 20%) sur une membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF) à 1 ampère pendant une heure ou équivalent dans un appareil de transfert humide ou 45 minutes à 0,7 ampère dans un appareil de transfert semi-sec.

Blocage de la membrane :

Retirer le blot de l'appareil et le placer immédiatement dans le tampon de blocage (1% BSA, 10 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1% Tween 20). Incuber 30 minutes à 37°C, 1 heure à température ambiante ou une nuit à +4°C.

Incubation avec l'anti Phosphotyrosine conjugué à la phosphatase alcaline :

Éliminer le tampon de blocage et ajouter l'anti phosphotyrosine conjugué à la phosphatase alcaline (Réf E120AP) dilué au 1/500 - 1/2000 dans le tampon de blocage. Incuber 20 minutes à 37°C, 1 heure à température ambiante ou une nuit à +4°C.

Incubation avec le substrat :

Éliminer la solution d'anticorps et ajouter le tampon de lavage (10 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1% Tween 20). Laver 30 minutes sous agitation en changeant le tampon de lavage toutes les 3-5 minutes. Retirer le tampon de lavage et rincer brièvement à l'eau distillée. Immerger le blot dans la solution de substrat : 100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2 contenant 0.5% v/v de BCIP et 0.5% v/v de NBT. Incuber à température ambiante jusqu'à l'obtention de la coloration désirée. Le développement de doit pas prendre plus de 15 minutes. Transférer le(s) blot(s) dans du PBS contenant 20 mM d'EDTA et laisser tremper 2-3 minutes. Rincer à l'eau distillée et laisser le(s) blot(s) sécher à l'air sur un papier absorbant.

Préparation des chromogènes :

Le BCIP (bromochloroindolyl phosphate) est préparé en dissolvant 0,5 g dans 10 ml de diméthylformamide. Le NBT (nitro blue tetrazolium) est préparé en dissolvant 0,5 g dans 10 ml de diméthylformamide à 70%. Stocker les solutions à +4°C à l'abri de la lumière.