PROTOCOLE Transduction Laboratories #3

Western blotting avec des anticorps monoclonaux

Préparation de l'échantillon:

Si un échantillon doit refléter exactement l'état des cellules au moment de la lyse, il est nécessaire de choisir une procédure qui préviendra l'action d'enzymes telles les protéases, phosphatases et kinases. Les protéines étrangères qui peuvent être présentes dans les milieux de culture, particulièrement l'albumine sérique et les immunoglobulines, affectent les concentrations en protéine et peuvent altérer leur migration électrophorétique. Par conséquent, pour la lyse de cultures de cellules adhérentes, il est indiqué d'éliminer le milieu de culture et de rincer rapidement les cellules avec du tampon PBS avant la lyse. Une fois les cellules rincées, jeter l'excès de PBS et l'éliminer par aspiration. A une boite de culture de 10 cm de diamètre, ajouter 1 ml de tampon d'échantillon d'électrophorèse 2X bouillant (1X = 125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 5% glycérol, 0,003% bleu de bromophénol, 1% b-mercaptoéthanol). Alternativement, les cellules rincées au PBS peuvent être lysées avec 1 ml de tampon de lyse bouillant (SDS 1%, Tris 10 mM, pH 7,4) pour une boite de 10 cm de diamètre. Racler les cellules de la boite, transférer dans un microtube et faire bouillir 5 minutes supplémentaires. La viscosité de l'échantillon peut être réduite par une brève sonication ou plusieurs passages à travers une aiguille de gauge 26. Centrifuger les échantillons 5 minutes pour éliminer le matériel insoluble. A ce point, il est possible de déterminer la concentration en protéine sur une petite aliquote par la méthode BCA (Pierce). Diluer l'échantillon pour ramener la concentration en SDS à 0,1 % pour éviter l'interférence du détergent avec la lecture colorimétrique. Cette méthode permet une meilleure comparaison des échantillons. Les échantillons sont alors prêts pour l'électrophorèse.

Les échantillons de tissus peuvent être préparés par homogénéisation rapide dans 5 fois leur volume de tampon de lyse bouillant (1% SDS, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4) et passage 10-15 secondes au micro-ondes. Centrifuger les homogénats 5 min (12,000 g, 15°C) pour éliminer le matériel insoluble.

Electrophorèse sur gel de polyacrylamide et blotting :

Si les échantillons ne sont pas déjà dilués, ajouter le tampon d'échantillon d'électrophorèse et faire bouillir 3 à 5 minutes. A chaque puits d'un gel de polyacrylamide-SDS de 0,5 à 0,75 mm d'épaisseur, appliquer 5-25 µl de lysat cellulaire ou homogénat de tissu (1-10 µg de protéine) et faire migrer.

Transférer (tampon de transfert : Tris 25 mM, glycine 190 mM, MeOH 20%) sur une membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF) à 1 ampère pendant une heure ou équivalent dans un appareil de transfert humide ou 45 minutes à 0,7 ampère dans un appareil de transfert semi-sec. Les protéines transférées peuvent être visualisées en colorant la membrane avec de l'india ink (Pelikan) diluée au 1/1000 dans le tampon de lavage (10 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20). Rincer l'excès de colorant avant de bloquer.

Blocage de la membrane :

Retirer le blot de l'appareil et le placer immédiatement dans le tampon de blocage (5% de lait écrémé ou 1% BSA pour détecter la phosphotyrosine, 10 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1% Tween 20). Incuber 30 minutes à 37°C, 1 heure à température ambiante ou une nuit à +4°C.

Incubation avec l'anticorps primaire :

Éliminer le tampon de blocage et ajouter l'anticorps primaire dilué dans le tampon de blocage selon les instructions fournies sur la fiche technique. Incuber sous agitation 20 minutes à 37°C, 1 heure à température ambiante ou une nuit à +4°C.

Incubation avec le conjugué immunoenzymatique :

Éliminer la solution d'anticorps primaire et ajouter du tampon de lavage (10 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1% Tween 20). Laver 30 minutes sous agitation et changer le tampon toutes les 5 minutes. Retirer le tampon de lavage et ajouter le conjugué anti IgG de souris-péroxydase (réf. M15345) dilué dans le tampon de lavage additionné de 5% de lait écrémé. Incuber dans les mêmes conditions que celles utilisées pour l'anticorps primaire.

Incubation avec le substrat :

Éliminer la solution d'anticorps et ajouter le tampon de lavage (10 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1% Tween 20). Laver 30 minutes sous agitation en changeant le tampon de lavage toutes les 5 minutes. Retirer le tampon de lavage et ôter l'excès d'humidité en épongeant rapidement le blot avec un papier absorbant. Ne pas laisser sécher les blots ! Placer le(s) blot(s) dans un sac plastique contenant le substrat chimioluminescent (SuperSignal CL-HRP substrate system Pierce Réf. 34080). Procéder comme recommandé par les instructions données avec le substrat. Déposer un film Kodak X-OMAT AR sur le(s) blot(s) jusqu'à l'exposition optimale. Une exposition initiale de 10 secondes est recommandée et devra être optimisée.