PROTOCOLE Transduction Laboratories #7

Immunoprécipitation avec des anticorps solubles

Préparation du lysat cellulaire (dénaturé):

Rincer les cellules confluantes d'une boite du culture de 60 mm avec du PBS puis effectuer la lyse par addition de 0,5 ml de tampon de lyse bouillant (1% SDS, 10 mM Tris-HCl pH 7,4). Transférer le lysat dans un microtube de 1,5 ml et faire bouillir 5 minutes de plus. Passer aux ultrasons brièvement ou passer plusieurs fois à travers une aiguille de gauge 26 et centrifuger 5 minutes. Le lysat obtenu est un «lysat cellulaire total (dénaturé)».

Préparation du lysat cellulaire (natif):

Rincer les cellules confluantes d'une boite du culture de 60 mm avec du PBS puis effectuer la lyse par addition de 0,5 ml de tampon d'immunoprécipitation froid (1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,2 mM sodium vanadate, 0,2 mM PMSF, 0,5% NP-40) sous agitation constante 30 minutes à +4°C. Gratter les cellules et passer la solution plusieurs fois à travers une aiguille de gauge 26 pour disperser les agrégats. Centrifuger le lysat 15 minutes à +4°C dans une micro centrifugeuse pour éliminer le matériel insoluble. Le surnageant obtenu est un «lysat cellulaire total (natif)».

Immunoprécipitation:

Dans un microtube, introduire 1-5 µg d'anticorps polyclonal ou monoclonal, 400 µl d'eau et 500 µl de tampon d'immunoprécipitation 2X (1X=1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,2 mM sodium vanadate, 0,2 mM PMSF, 0,5% NP-40) et 100 µl de lysat cellulaire total (200-500 µg de protéine). Vortexer et incuber 1 heure à +4°C. (Si la précipitation est faite par un monoclonal, ajouter 5 µg de lapin anti IgG de souris (Uptima Réf. UP899400), vortexer et poursuivre l'incubation 30 minutes supplémentaires à +4°C). Ajouter 50 µl d'une suspension à 10% de protéine A* (S. aureus, souche Cowan) ou de protéine A-agarose (Repligen IPA300). Vortexer et incuber sous agitation 30 minutes à +4°C. Laver 3 fois avec le tampon d'immunoprécipitation 1X et récupérer à chaque fois le précipité par une centrifugation de 4 minutes. Resuspendre le culot dans 30 µl de tampon d'échantillon d'électrophorèse 2X, faire bouillir 5 minutes et centrifuger 5 minutes. Appliquer le surnageant sur un gel de polyacrylamide-SDS et faire migrer normalement. Transférer les protéines sur une membrane de PVDF et marquer avec les anticorps appropriés.

Notes:

Un bruit de fond plus important peut être observé lorsque des cellules radiomarquées sont utilisées comme matériel de départ. Dans ce cas, il est nécessaire d'utiliser des procédures de lavage plus rigoureuses. Pour des méthodes alternatives, consultez l'ouvrage Antibodies : A Laboratory Manual, (Harlow, E. and Lane, D. Eds.) Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 (Pierce Réf. 15050).

* Préparation de la protéine A:

Utiliser la Pansorbin® Calbiochem (suspension à 10% de cellules de S. aureus fixées au formol). Centrifuger la suspension 10 minutes à 12 000 g, éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans un tampon 10 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS, et 5 mM b-mercaptoethanol. Faire bouillir la suspension 15 minutes et faire refroidir dans un bac de glace. Centrifuger la suspension 10 minutes à 12 000 g à +4°C et éliminer le surnageant. Laver le culot par resuspension dans deux fois son volume de tampon d'immunoprécipitation 1X froid et centrifuger cette suspension comme précédemment. Répéter le lavage 4 fois pour éliminer le SDS et le b-mercaptoéthanol. Finalement, resuspendre la protéine A dans le volume initial de tampon d'immunoprécipitation pour obtenir une suspension à 10%. Stocker à -20°C en aliquotes de 0,5 ml