PROTOCOLE Transduction Laboratories #8

Immunoprécipitation avec des anticorps couplés sur agarose

Préparation du lysat cellulaire (dénaturé):

Rincer les cellules confluantes d'une boite du culture de 60 mm avec du PBS puis effectuer la lyse par addition de 0,5 ml de tampon de lyse bouillant (1% SDS, 10 mM Tris-HCl pH 7,4). Transférer le lysat dans un microtube de 1,5 ml et faire bouillir 5 minutes de plus. Passer aux ultrasons brièvement ou passer plusieurs fois à travers une aiguille de gauge 26 et centrifuger 5 minutes. Le lysat obtenu est un «lysat cellulaire total (dénaturé)».

Préparation du lysat cellulaire (natif):

Rincer les cellules confluantes d'une boite du culture de 60 mm avec du PBS puis effectuer la lyse par addition de 0,5 ml de tampon d'immunoprécipitation froid (1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,2 mM sodium vanadate, 0,2 mM PMSF, 0,5% NP-40) sous agitation constante 30 minutes à +4°C. Gratter les cellules et passer la solution plusieurs fois à travers une aiguille de gauge 26 pour disperser les agrégats. Centrifuger le lysat 15 minutes à +4°C dans une micro centrifugeuse pour éliminer le matériel insoluble. Le surnageant obtenu est un «lysat cellulaire total (natif)».

Immunoprécipitation:

Dans un microtube, introduire 25 µl d'une suspension à 50% d'anticorps-agarose, 400 µl d'eau, 500 µl de tampon d'immunoprécipitation 2X (1X=1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,2 mM sodium vanadate, 0,2 mM PMSF, 0,5% NP-40) et 100 µl de lysat cellulaire (200-500 µg de protéine). Vortexer et incuber I heure à +4°C. Laver avec le tampon d'immunoprécipitation 1X et centrifuger 4 minutes. Répéter le lavage. Resuspendre le culot dans 30 µl de tampon d'échantillon d'électrophorèse 2X, faire bouillir 5 minutes et centrifuger 5 minutes. Appliquer le surnageant sur un gel de polyacrylamide-SDS et faire migrer normalement. Transférer les protéines sur une membrane de PVDF et marquer avec les anticorps appropriés.

Notes:

Un bruit de fond plus important peut être observé lorsque des cellules radiomarquées sont utilisées comme matériel de départ. Dans ce cas, il est nécessaire d'utiliser des procédures de lavage plus rigoureuses. Pour des méthodes alternatives, consultez l'ouvrage Antibodies : A Laboratory Manual, (Harlow, E. and Lane, D. Eds.) Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 (Pierce Réf. 15050).