PROTOCOLE Transduction Laboratories #9

Marquage de cellules pour l'immunofluorescence

Fixation des cellules:

Rincer les cellules confluantes d'une boite du culture de 60 mm avec du PBS puis effectuer la lyse par addition de 0,5 ml de tampon de lyse bouillant (1% SDS, 10 mM Tris-HCl pH 7,4). Transférer le lysat dans un microtube de 1,5 ml et faire bouillir 5 minutes de plus. Passer aux ultrasons brièvement ou passer plusieurs fois à travers une aiguille de gauge 26 et centrifuger 5 minutes. Le lysat obtenu est un «lysat cellulaire total (dénaturé)».

Les deux méthodes de fixation suivantes permettent une rapide évaluation de la distribution cellulaire d'un antigène particulier :

• Méthanol/acétone : cultivez les cellules sur des lamelles de verre. Fixez et perméabilisez les par immersion pendant 10 minutes dans un mélange acétone/éthanol (1:1). Laissez sécher à l'air.

• Formaldéhyde : Les cellules cultivées sur lamelles de verre sont rincées brièvement dans du PBS et immergées pendant 10 minutes dans du formaldéhyde* à 3,7% dans du tampon PBS + 0,2% de Triton X-100. Les lamelles sont ensuite rincées 3 fois 5 minutes dans du PBS.

Blocage:

Placer les lamelles sur un morceau de papier filtre dans une boite de Petri, en plaçant vers le haut la face portant les cellules. Couvrir les cellules avec une solution à 2% de BSA en PBS pendant 10 minutes pour réduire l'adsorption non-spécifique des anticorps sur la lamelle de verre (25-50 µl sont généralement suffisants).

Incubation avec l'anticorps primaire:

Éliminer le tampon de blocage en tournant la lamelle sur sa tranche sur un papier absorbant. Ajouter 25-50 µl d'anticorps primaire dilué dans le tampon de blocage. La concentration de l'anticorps dépendra de plusieurs variables dont l'affinité de l'anticorps et l'abondance de l'antigène. Il est recommandé d'utiliser une concentration initiale en anticorps de 1-10 µg/ml. Très souvent, il est utile d'observer la co-distribution de deux antigènes différents sur la même préparation. A cette fin, il est possible de réaliser un double marquage en incubant la préparation avec deux anticorps primaires simultanément pourvu qu'ils soient monospécifiques et obtenus dans des espèces différentes. Les lamelles sont incubées 45 minutes à température ambiante. La solution d'anticorps primaire est alors retirée et les lamelles lavées 3 fois 5 minutes avec du PBS.

Incubation avec l'anticorps secondaire:

Les lamelles portant les cellules sur le dessus sont ensuite incubées avec l'anticorps secondaire couplé à un fluorochrome, c'est à dire un anti souris ou anti lapin FITC ou TRITC en fonction de l'origine de l'anticorps primaire. Nous recommandons l'emploi d'anticorps purifiés par affinité et épuisés (Jackson ImmunoResearch) pour réduire le bruit de fond et le marquage non spécifique du à l'anticorps secondaire. Des anticorps conjugués de grande qualité sont nécessaires pour éviter les réactions croisées entre deux anticorps différents dans les procédures de double marquage (Jackson ImmunoResearch produit des anticorps réalisés chez l'ane spécialement destinés à cet usage). Les lamelles sont incubées avec l'anticorps secondaire 30 minutes à température ambiante. Une fois encore, cette incubation s'effectue en plaçant la lamelle, cellules sur le dessus, sur une feuille de papier filtre dans une boite de petri. Diluer l'anticorps secondaire à la concentration appropriée avec du tampon de blocage. Déposer suffisamment d'anticorps secondaire pour couvrir la surface de la lamelle (habituellement 10-25 µl). A la fin de l'incubation, éliminer la solution d'anticorps en plaçant la lamelle sur sa tranche sur un papier absorbant. Laver les lamelles 3 fois 5 minutes avec du PBS.

Incubation avec un anticorps primaire conjugué à un fluorochrome:

Si l'anticorps primaire est conjugué à un fluorochrome, le marquage avec un anticorps secondaire n'est pas nécessaire. Transduction Laboratories propose l'anti macNOS marqué au FITC. Incuber les lamelles fixées et bloquées avec l'anticorps dilué au 1:25 - 1:100 pendant 45 minutes à 1 heure à 37°C. Laver les lamelles 3 fois 5 minutes avec du PBS

Préparation pour l'observation:

Déposer la lamelle, cellules en dessous, sur une lame sur laquelle auront été préalablement déposés 10 µl de milieu de montage (PBS ajusté à pH 8,0, 50% glycérol, 0,1% r-phénylènediamine). Oter l'excès de milieu de montage avec un papier absorbant sans déplacer la lamelle. En sceller les bords avec du vernis à ongles transparent et laisser sécher 3 minutes. Cette procédure donne une préparation semi-permanente. Les cellules sont maintenant prêtes pour l'observation au microscope.

*le formaldéhyde doit être préparé extemporanément à parti du polymère para. Ce composé est toxique est doit être manipulé avec précautions sous une hotte.