HISTAGcatcher

 

Le système HISTAGcatcher

Protocole HISTAGcatcher

Applications du système HISTAGcatcher

Le système HISTAGcatcher est destiné à la détection et purification rapide des protéines de fusion marquées à la polyhistidine et exprimées dans des bactéries, levures ou cellules eucaryotes. La technique repose sur l’emploi de filtres centrifuges pour manipuler une résine chargée en ions nickel. Toutes les étapes d’adsorption, lavage et élution des protéines de fusion s’effectuent sur ces filtres qui évitent la chromatographie sur colonne. La purification est ainsi effectuée en moins de 30 minutes.

Les composants du système HISTAGcatcher ont été optimisés pour aboutir à une technique présentant de nombreux avantages :

La procédure de purification des protéines marquées à la polyhistidine est décrite sur le schéma 1. Selon sa solubilité, la protéine recombinante est soit extraite dans un tampon Tris contenant des inhibiteurs de protéases soit dans une solution de Guanidine ou d’urée.

La résine chargée en ions Ni2+ est alors ajoutée à cette solution. Elle est ensuite récupérée dans un filtre centrifuge. Après deux lavages, la protéine recombinante purifiée est éluée soit avec une solution «SDS-PAGE» pour l’analyse soit avec une solution d’imidazole. La procédure prend moins de 30 minutes et 24 échantillons ou plus peuvent être traités simultanément.

Détection et purification

de protéines recombinantes marquées His-Tag

Le système HISTAGcatcher comporte des filtres à centrifuger à faible adsorption qui permettent l’élimination rapide des protéines contaminantes. Ces filtres, combinés avec la résine d’affinité et les tampons optimisés fournissent un moyen rapide pour isoler les proteines de fusion à partir de lysats cellulaires.

  • Rapide : Il est possible de traiter plusieurs échantillons en moins de 30 minutes.

  • Simple : Le filtre centrifuge évite les étapes de resuspension.

  • Prêt à l’emploi : Le coffret comprend les inhibiteurs de protéases et toutes les solutions nécessaires à l’extraction des protéines et à leur purification.

  • Flexible : Les solutions fournies permettent de traiter aussi bien les protéines solubles que les protéines insolubles.

  • Faible bruit de fond : Le procédé de purification est spécifique des marqueurs de polyhistidine, les protéines contaninantes sont effectivement éliminées. Les filtres employés sont destinés à l’utilisation en biologie, ils présentent un taux d’adsorption minimal.

  • Rendements élevés : Les protéines fixées sur le gel sont récupérées à plus de 90%.Protocole

Capture

Centrifugation

Centrifugation

Incuber le lysat cellulaire avec la résine chargées en Ni2+

Récupérer la protéine His-Tag liée

Laver la résine

Eluer la protéine His-Tag

Gaq

Ras

 

Applications du système HISTAGcatcher

Criblage de colonies

Détection de protéines dissoutes en guanidine HCl

Etude d’interactions protéine /protéine

Les colonies bactériennes peuvent être testées rapidement pour l’expression de la protéine recherchée. Les clones positifs peuvent être identifiés en moins de 2 heures et les protéines purifiées peuvent immédiatement faire l’objet d’une mesure d’activité. Ces possibilités font du système HISTAGcatcher une excellente alternative au criblage par PCR.

La plupart des protéines recombinantes produites sous forme de corps d’inclusion sont dissoutes dans du chlorhydrate de Guanidine. La détection de ces protéines nécessite une dialyse pour éliminer la guanidine incompatible avec le SDS-PAGE. Avec le HISTAGcatcher, CytoSignal a développé une technique permettant d’identifier en moins de 2 heures les fractions contenant la protéine d’intérêt.

Il est possible d’étudier les interactions protéine/protéine en co-précipitant, à l’aide de la résine chargée en nickel, une protéine native interagissant avec une protéine marquée au HisTag. Après élution, il est possible de distinguer les différentes protéines par SDS-PAGE. De même, les conditions optimales d’interaction peuvent être facilement déterminées.
charge lavage éluat

Phosducine His-Tag - Gb - Gg

extrait protéique - Ga11

Ga11

3 10 14 17 18 20 22 24 Lysat 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4
             N° de fraction          N° de colonie

 

Nature Réf Nature Réf Nature Réf

HISTAGcatcher

(20 Préparations)

 C01-020

HISTAGcatcher

(50 Préparations)

 C01-050

HISTAGcatcher

Solutions

 C01-001

Composition:

  • 20 Spin Filters

  • 40 Collection Tubes

  • 0.25 ml Nickel ion-charged Resin

  • 10 ml 5X Tris Stock Solution

  • 20 ml Guanidine HCl Solution

  • 20 ml Urea Solution

  • 20 ml Detergent Solution

  • 10 µg His-Tag Protein Control

  • 1 ml SDS-PAGE Sample Solution

  • 1 ml Imidazole Solution

  • Protease Inhibitors

Composition:

  • 50 Spin Filters

  • 100 Collection Tubes

  • 0.6 ml Nickel ion-charged Resin

  • 25 ml 5X Tris Stock Solution

  • 50 ml Guanidine HCl Solution

  • 50 ml Urea Solution

  • 50 ml Detergent Solution

  • 25 µg His-Tag Protein Control

  • 2 ml SDS-PAGE Sample Solution

  • 2 ml Imidazole Solution

  • Protease Inhibitors

Composition:

  • 2 Bottles of 50 ml 5X Tris Stock Solution

  • 2 Bottles of 50 ml Guanidine HCl Solution

  • 2 Bottles of 50 ml Urea Solution

  • 2 Bottles of 50 ml Detergent Solution

  • 2 Tubes of 2 ml Imidazole Solution

  • 2 Tubes of 2 ml SDS-PAGE Sample Solution

Spin Filters &Collection Tubes

 C00-100

Composition :

  • 100 Spin Filters

  • 200 Collection Tubes

 

 

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