Foire Aux Questions

SuperSignal Western Blotting

Combien de temps le kit SuperSignal Western blotting est-il stable ?

Le SuperSignal Western Blotting est stable un an à température ambiante et 2 ans à +4°C. 

Le SuperSignal Western blotting existe-t-il en petits conditionnements ?

Le SuperSignal Western blotting existe en conditionnement d'essai de 50 ml.

Une bande intense peut-elle amplifier une bande voisine ?

Non, l'émission est localisée sur la bande. Si le signal pouvait diffuser, il créerait un bruit de fond autour de la bande intense.

Les bandes majeures diminuent ou disparaissent au cours du temps, des inversions de bandes sont observées.

Ce phénomène est normal et reflète la cinétique de la réaction. Une bande de forte intensité reflète une concentration importante de péroxydase. La quantité de substrat étant limitée au niveau de la membrane, le signal observé au niveau d'une bande sera d'autant plus bref que son intensité initiale sera élevée.

Si possible, il est recommandé d'ajuster la quantité de protéine déposée sur le gel pour obtenir des bandes d'intensités relativement égales. Dans le cas ou une protéine est très abondante, il est nécessaire de réaliser deux blots, l'un normal l'autre avec un dépot initial plus faible (il est possible de diluer l'échantillon protéique et de tenir compte ensuite du facteur de dilution lors de l'interprétation des blots).

J'obtiens des bandes en négatif (bandes blanches sur fond noir)

Les bandes en négatif sont occasionnées par des anticorps trop concentrés. Ils occasionnent un bruit de fond important et se fixent en grande quantité sur les bandes de protéines, le substrat est alors oxydé très rapidement et ne donne aucun signal sur le film. En pareil cas, il est nécessaire d'optimiser les dilutions des deux anticorps. Pour des anticorps en solution à 1 mg/ml, il est recommandé de les diluer au 1/500-1/1,000 pour le primaire et 1/10,000 - 1/100,000 pour le secondaire.

L'intensité émise en fonction de la quantité de protéine sur le blot est-elle une relation linéaire.

Non, l'intensité émise au niveau d'une bande augmente proportionnellement à la quantité de protéine présente mais la relation n'est pas linéaire.

Un seuil maximal existe mais qui varie pour chaque système expérimental et doit être déterminé empiriquement.

Mon blot émet une luminescence bleue, visible à l'oeil nu en chambre noire.

L'émission est trop intense et occasionnera des bandes et un bruit de fond très intenses. Il est possible de tenter une exposition en posant le blot sur le film et en le retirant immédiatement. Il est plutôt recommandé de stripper le blot et de recommencer la procédure à partir du blocage. Dans certains cas, si le blot est luminescent sur toute sa surface, il convient d'utiliser un autre bloquant.

Quel volume de tampon de lavage est recommandé pour réduire le bruit de fond ?

Il est recommandé d'employer un grand volume de tampon, 0,5 - 1 ml de solution par cm2 de membrane est satisfaisant.

Est-il possible de réutiliser une solution d'anticorps primaire?

Il est possible d'utiliser plusieurs fois une solution d'anticorps primaire, le risque existe de baisser la sensibilité avec le nombre d'utilisations. Les anticorps sont peu stables en solutions diluées, il est important de les utiliser sur une période assez brève.

Est-il possible de détecter un deuxième antigène sans stripper le blot ?

La méthode la plus facile consiste à inactiver la péroxydase par chauffage à 55°C, elle est moins agressive pour les antigènes que le stripping à pH acide.

Comment la température affecte-t-elle la fixation des anticorps et le blocage ?

Réaliser les incubations à 37°C accélère la fixation des protéines, que ce soit lors du blocage ou de l'incubation avec les anticorps. Pour les antigènes labiles, les incubations doivent se faire à température ambiante ou +4°C, il est alors nécessaire d'allonger leur durée.

Quelques conseils d'utilisation:

Le SuperSignal est un substrat très sensible, pour obtenir les meilleurs résultats, il est impératif de respecter certaines précautions :

Re-optimisez la dilution de vos anticorps :

Pour des anticorps en solution à 1 mg/ml, il est recommandé de les diluer au 1/500-1/1,000 pour le primaire et 1/10,000 - 1/100,000 pour le secondaire.

Aux chercheurs utilisant des protocoles mis au point avec l'ECL Amersham, il est recommandé d'augmenter d'un facteur 10 la dilution du second anticorps et de réoptimiser à partir de cette base.

Réduisez le bruit de fond :

Le bruit de fond n'est pas "occasionné" par le SuperSignal. Du fait de sa forte sensibilité, notre substrat détecte tout conjugué péroxydase, que le marquage soit spécifique ou non. Les facteurs réduisant le bruit de fond :

Optimiser la dilution des anticorps

Il est nécessaire de faire 4 à 6 lavages de 10 minutes sous agitation, spécialement après l'addition du conjugué péroxydase

Dans certains cas, il peut s'avérer nécessaire de tester plusieurs bloquants

Respectez la préincubation dans le substrat :

Dans les conditions optimales d'utilisation (anticorps à la bonne dilution), le SuperSignal nécessite quelques minutes pour atteindre son maximum d'émission. Il est nécessaire d'incuber le blot dans le substrat 5 à 10 minutes avant d'exposer le film.