Diminuer le bruit de fond généré par un anticorps secondaire
Posted: Tue 9 Dec 2014 17:22Comment diminuer le bruit de fond généré par mon anticorps secondaire ?
1) Vérifiez vos étapes de blocage :
Il n'y a pas d'agent universel pour saturer les sites de fixation non spécifique pour les immunoréactifs, notamment les anticorps primaires et secondaires.
Les saturants usuels (lait écrémé, BSA, gélatine,...) conviennent souvent, et quand ils génèrent un bruit de fond gênant, il s'agit d'opter sur des saturants plus adaptés selon les raisons du bruit de fond, et parfois tester une ou plusieurs solutions.
- Attention au lait et à la BSA ! Ces agents de blocage courants contiennent souvent des traces d’immunoglobulines bovines qui sont assez similaires aux immunoglobulines de chèvre ou de mouton. A ne pas utilisez si votre anticorps primaire a été produit chez le bovin, la chèvre ou le mouton, car votre anticorps secondaire risque de reconnaitre l’agent de blocage en même temps que l’anticorps primaire et généré du bruit de fond.
- On obtient souvent de bons résultats en utilisant une dilution à 1-5% d’un sérum correspondant à l’espèce hôte de l’anticorps secondaire (mais surtout pas celle de l’anticorps primaire car les Ig présentes dans le sérum pourraient être reconnues par le secondaire).
Exemple : Si votre anticorps primaire est fait chez la souris et que vous le révélez avec un Chévre anti-Souris : utilisez un sérum de chèvre pour bloquer.
- De bons résultats sont également souvent obtenus avec des saturants dépourvus d'IgG et composants mammaliens, par exemple le SeaBlock. Consulter le catalogue Biosciences Innovations.
2) Optimisez vos anticorps secondaires
- Vérifiez si la dilution utilisée pour l’anticorps secondaire n’est pas trop forte (anticorps trop concentré).
- Sélectionnez si possible un anticorps épuisé contre l’espèce de votre modèle expérimental. Si vous travaillez sur un tissu humain, choisissez un anticorps pré-absorbé sur des protéines humaines (serum, IgG). Si votre tissu contient des immunoglobulines endogènes, un blocage avec des fragments Fab pourra être utile (Fab anti humain s’il s’agit d’Ig humaines endogènes).
- Il peut être utile de changer de système de détection: changer d'espèce d'anticorps (passer d'un anticorps secondaire produit chez le lapin à un anticorps d’âne; passer d'un acm d'isotype IgG2a à une IgG1 ou d'un IgM à une IgG)
- A l'inverse, l'emploi d'un anticorps primaire suivi d'un secondaire peut permettre de résoudre un bruit de fond lié à une détection amplifiée alors que cette dernière n'est pas justifiée vu les cibles et la sensibilité requise; une détection via un anticorps biotinylé peut réussir là où un système avec protéineA/F/L pose problème, ou l'inverse.
3) Contrôlez et optimisez les autres étapes:
- Envisagez un éventuel problème de lavage: trop de lames/blots dans un même bain de lavage, durée de lavage à augmenter pour les tissus épais, améliorez la circulation ou mélange du bain de lavage, augmentez son volume ou le nombre de lavage, changer de tampon (le PBS convient le plus souvent, mais par exemple pour la détection avec phosphatase alcaline (AP) l'on recommande alors du TBS).
- Vérifiez si la dilution utilisée pour l’anticorps secondaire n’est pas trop concentrée.
1) Vérifiez vos étapes de blocage :
Il n'y a pas d'agent universel pour saturer les sites de fixation non spécifique pour les immunoréactifs, notamment les anticorps primaires et secondaires.
Les saturants usuels (lait écrémé, BSA, gélatine,...) conviennent souvent, et quand ils génèrent un bruit de fond gênant, il s'agit d'opter sur des saturants plus adaptés selon les raisons du bruit de fond, et parfois tester une ou plusieurs solutions.
- Attention au lait et à la BSA ! Ces agents de blocage courants contiennent souvent des traces d’immunoglobulines bovines qui sont assez similaires aux immunoglobulines de chèvre ou de mouton. A ne pas utilisez si votre anticorps primaire a été produit chez le bovin, la chèvre ou le mouton, car votre anticorps secondaire risque de reconnaitre l’agent de blocage en même temps que l’anticorps primaire et généré du bruit de fond.
- On obtient souvent de bons résultats en utilisant une dilution à 1-5% d’un sérum correspondant à l’espèce hôte de l’anticorps secondaire (mais surtout pas celle de l’anticorps primaire car les Ig présentes dans le sérum pourraient être reconnues par le secondaire).
Exemple : Si votre anticorps primaire est fait chez la souris et que vous le révélez avec un Chévre anti-Souris : utilisez un sérum de chèvre pour bloquer.
- De bons résultats sont également souvent obtenus avec des saturants dépourvus d'IgG et composants mammaliens, par exemple le SeaBlock. Consulter le catalogue Biosciences Innovations.
2) Optimisez vos anticorps secondaires
- Vérifiez si la dilution utilisée pour l’anticorps secondaire n’est pas trop forte (anticorps trop concentré).
- Sélectionnez si possible un anticorps épuisé contre l’espèce de votre modèle expérimental. Si vous travaillez sur un tissu humain, choisissez un anticorps pré-absorbé sur des protéines humaines (serum, IgG). Si votre tissu contient des immunoglobulines endogènes, un blocage avec des fragments Fab pourra être utile (Fab anti humain s’il s’agit d’Ig humaines endogènes).
- Il peut être utile de changer de système de détection: changer d'espèce d'anticorps (passer d'un anticorps secondaire produit chez le lapin à un anticorps d’âne; passer d'un acm d'isotype IgG2a à une IgG1 ou d'un IgM à une IgG)
- A l'inverse, l'emploi d'un anticorps primaire suivi d'un secondaire peut permettre de résoudre un bruit de fond lié à une détection amplifiée alors que cette dernière n'est pas justifiée vu les cibles et la sensibilité requise; une détection via un anticorps biotinylé peut réussir là où un système avec protéineA/F/L pose problème, ou l'inverse.
3) Contrôlez et optimisez les autres étapes:
- Envisagez un éventuel problème de lavage: trop de lames/blots dans un même bain de lavage, durée de lavage à augmenter pour les tissus épais, améliorez la circulation ou mélange du bain de lavage, augmentez son volume ou le nombre de lavage, changer de tampon (le PBS convient le plus souvent, mais par exemple pour la détection avec phosphatase alcaline (AP) l'on recommande alors du TBS).
- Vérifiez si la dilution utilisée pour l’anticorps secondaire n’est pas trop concentrée.