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Bonjour,

Je vais utiliser le kit de couplage Lightning-Link rapid conjugation system (avec dylight 405)

J’ai un Ac purifié à 4.8 mg/ml, un autre à 1.8 mg/ml, un 3ème à 1 mg/ml
Dans le protocole, il est écrit « Ac de 1 à 2.5 mg/ml » => je dilue en PBS celui à 4.8 mg/ml
Et « 1 µl de LL-rapid modifier reagent pour chaque 10 µl d’Ac » « 10 µg à 2 mg » :
- je prépare mon Ac à concentration de 1 à 2.5 mg/ml
- je prélève x * 10 µl
- j’ajoute x µl de LL-rapid modifier reagent
- j’agite doucement : *DUREE, TEMPERATURE svp ?
*incubation avec LL rapid mix 15 min ou plus DUREE MAX svp ?
et enfin addition de LL rapid quencher

Vaut-il mieux me placer au milieu à environ 1 mg d’Ac couplé ou me mettre au maximum si j’ai assez d’Ac ?

Tous autres conseils seront bienvenus !

Cordialement

Bonjour GingerSmf,

Pour répondre à vos diverses questions :

Pour l'Ac purifié à 4.8 mg/ml: en effet, il est conseillé de diluer votre anticorps a 4.8mg/ml en PBS jusqu’à 1-2.5mg/ml
Pour l'anticorps à 2.5mg/ml: si vous voulez marquer 100µg d'anticorps, vous prélèverez 40µl d'anticorps auquel vous ajouterez 4µl de modifier (mélange doux par aspiration refoulement à la pipette à température ambiante, quelques secondes suffisent)
Pour l'anticorps à 1mg/ml: si vous voulez marquer 100µg d'anticorps, vous prélèverez 100µl d'anticorps auquel vous ajouterez 10µl de modifier

Ensuite l'incubation avec le mix est prévue pour 15 à 20min à température ambiante (vous pouvez éventuellement allez jusqu’à 3h à température ambiante ou overnight a 4°c).
- ajouter du quencher (même qté que le modifier)

Enfin, pour les quantités à coupler, cela dépend du kit que vous allez utiliser :
S'il s'agit du kit 100-200µg : restez dans cette plage (le choix de la qté dans la plage peut influer légèrement sur le ratio de couplage)
Si vous utilisez le kit 1-2mg : restez également dans cette plage.

A titre informatif, la vidéo d'utilisation du kit est disponible sur ce lien :
https://www.youtube.com/watch?v=kUnBoOmfh1o&feature=player_embedded

Bien cordialement,

Interchim