PROTOCOLE Transduction Laboratories #5

Immunoprécipitation avec un anti phosphotyrosine biotinylé (RC20)

Préparation du lysat cellulaire (dénaturé):

Rincer les cellules confluantes d'une boite du culture de 60 mm avec du PBS puis effectuer la lyse par addition de 0,5 ml de tampon de lyse bouillant (1% SDS, 10 mM Tris-HCl pH 7,4). Transférer le lysat dans un microtube de 1,5 ml et faire bouillir 5 minutes de plus. Passer aux ultrasons brièvement ou passer plusieurs fois à travers une aiguille de gauge 26 et centrifuger 5 minutes. Le lysat obtenu est un «lysat cellulaire total (dénaturé)».

Préparation du lysat cellulaire (natif) :

Rincer les cellules confluantes d'une boite du culture de 60 mm avec du PBS puis effectuer la lyse par addition de 0,5 ml de tampon d'immunoprécipitation froid (1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,2 mM sodium vanadate, 0,2 mM PMSF, 0,5% NP-40) sous agitation constante 30 minutes à +4°C. Gratter les cellules et passer la solution plusieurs fois à travers une aiguille de gauge 26 pour disperser les agrégats. Centrifuger le lysat 15 minutes à +4°C dans une micro centrifugeuse pour éliminer le matériel insoluble. Le surnageant obtenu est un «lysat cellulaire total (natif)».

Immunoprécipitation :

Dans un microtube, introduire 2-5 µg d'anticorps anti phosphotyrosine biotinylé (réf. E120B), 400 µl d'eau et 500 µl de tampon d'immunoprécipitation 2X (1X=1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,2 mM sodium vanadate, 0,2 mM PMSF, 0,5% NP-40) et 100 µl de lysat cellulaire total (200-500 µg de protéine). Vortexer et incuber 1 heure à +4°C. Ajouter 20 µl de streptavidine immobilisée sur agarose (Pierce) et incuber sous agitation 30 minutes à +4°C. Laver avec le tampon d'immunoprécipitation 1X et centrifuger 4 minutes dans une micro centrifugeuse. Répéter le lavage. Resuspendre le culot dans 30 µl de tampon d'échantillon d'électrophorèse 2X, faire bouillir 5 minutes puis centrifuger 5 minutes. Appliquer le surnageant sur un gel de polyacrylamide-SDS et faire migrer normalement. Transférer les protéines sur une membrane de PVDF et marquer avec les anticorps appropriés. Il est également possible de packer la streptavidine agarose dans une colonne et de purifier sélectivement les protéines contenant la phosphotyrosine en les éluant avec du phényl phosphate 10 mM.