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Substrat TMB Solution

Le substrat TMB en solution est un substrat chromogénique stabilisé de la peroxydase. Il est employé dans les dosages ELISA. Il est conditionné dans un flacon unique contenant un mélange de 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) et de peroxyde d’hydrogène (H₂O₂). Par rapport au substrat seul, la stabilité et la sensibilité du mélange sont grandement améliorées. La solution développe une coloration bleue foncée en présence de conjugués à la péroxydase. Ce substrat n’est pas utilisable en Immunohistochimie ou en Western Blotting.

Recommandations de manipulations : le substrat TMB est sensible à certaines conditions de stockage et de manipulations

• Exposition à la lumière : le substrat est très sensible à la lumière. Il  doit être stocké dans des flacons ambrés en plastique ou en verre de haute qualité.

• Matériaux : Le substrat est très sensible aux ions métalliques. Seuls des aciers, plastiques ou verres de hautes qualités doivent être utilisés.

• Eviter l’utilisation de bouchons présentant des joints en caoutchouc : celui ci est supposé avoir des effets néfastes sur le substrat.

• Ne jamais pipeter directement dans le flacon de substrat TMB : verser au préalable dans un récipient la quantité nécessaire de solution.

• Ne pas laisser le flacon ouvert trop longtemps.

Protocole

Il n’est pas nécessaire de ramener à température ambiante avant emploi le substrat TMB. Le substrat est prêt à l’emploi.

• Laver parfaitement les plaques afin d’éliminer tous les anticorps non liés.

• Ajouter 150 µl de substrat dans chaque puit

• Laisser agir 30 mn à température ambiante. Agiter doucement les plaques pour bien mélanger le substrat. La couleur se développe immédiatement.

Note : si la réaction enzymatique est trop rapide ou trop intense, les anticorps primaires ou secondaires doivent être plus dilué. Il n’est pas recommandé de diluer le substrat.

• Après 30 mn lire l’absorbance à 630-650 nm. La longueur d’onde recommandée est 650 nm. Si un lecteur à double longueur est utilisé, lire à 650 nm et 490 nm.

Note : le volume par puit et les temps d’incubation du substrat doivent être ajustés selon votre système.

• Arrêt de la réaction : ajouter 100 µl de solution d’arrêt (1 M HCl ou 1 M H2SO4) dans chaque puit. La couleur de la solution devient jaune. Lire l’absorbance à 450 nm dans les 30 mn suivant l’addition de la solution stop. Si la solution est l’acide chlorhydrique la lecture peut être effectuée dans les 2 heures.

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